趙 靜，梁建生，吳雪玲，劉曉琴，栗會(huì)召，朱素琴＊

（1 南通大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南通226007；2 南方科技大學(xué)，廣東深圳518055）

植物響應(yīng)高鹽／低溫脅迫的氧化還原控制途徑是一個(gè)龐雜的抗氧化體系，該體系是在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體（基質(zhì)、類(lèi)囊體膜）和線粒體（內(nèi)膜和基質(zhì)）等中進(jìn)行的酶促和非酶促生化反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)體系，涉及到光合電子傳遞、呼吸鏈電子傳遞。植物體內(nèi)的活性氧（ROS）由抗氧化的非酶類(lèi)物質(zhì)如抗壞血酸（ASC）、谷胱甘肽（GSH）、生育酚等和抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等組成的抗氧化系統(tǒng)清除。水－水循環(huán)以及抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)在植物抗氧化系統(tǒng)中起著重要作用［1］。植物的抗氧化系統(tǒng)活性明顯受到環(huán)境脅迫因子的影響，并且與光合作用密切相關(guān)。當(dāng)光合速率和電子傳遞能力處于最佳狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)維持本底水平的運(yùn)行。逆境條件如低溫、高鹽、干旱等脅迫下，光合速率和電子傳遞速率都因逆境因子的影響而顯著下降，此時(shí)抗氧化系統(tǒng)中的谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（ASC）含量都上升到最高值?？箟难嵩谥参矬w內(nèi)有多種重要功能，首先，在光保護(hù)過(guò)程中起著重要作用，調(diào)節(jié)非光化學(xué)淬滅（NPQ）和光化學(xué)淬滅的強(qiáng)度，直接調(diào)節(jié)紫黃質(zhì)去環(huán)氧化酶的活性從而調(diào)節(jié)紫黃質(zhì)循環(huán)的強(qiáng)度［2］。其次，它是細(xì)胞內(nèi)外重要的抗氧化物質(zhì)。ASC 可直接與活性氧反應(yīng)而將其還原，又可作為酶的底物在活性氧的清除過(guò)程中起作用，即在葉綠體類(lèi)囊體表面作為還原劑參與抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）介導(dǎo)的H2O2的清除過(guò)程。在這一過(guò)程中，ASC 氧化成單脫氫抗壞血酸（MDHA）。葉綠體中APX 發(fā)揮正常的催化作用時(shí)，需要依賴(lài)單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、鐵氧還蛋白（ferredoxin，F(xiàn)d）和谷氧還蛋白（GLR）等參與的4種反應(yīng)源源不斷地再生ASC。如ASC 分別利用NAD（P）H 或谷胱甘肽（GSH）作為電子供體，由MDHAR 或DHAR 催化過(guò)氧化物酶反應(yīng)中的氧化產(chǎn)物得以再生，而這2種電子供體又可利用來(lái)自類(lèi)囊體的電子再生［3］。由于ASC在清除活性氧的過(guò)程中發(fā)揮作用，故在葉綠體中，它與氧的攝入、APX的功能及分子氧還原相關(guān)的過(guò)程統(tǒng)稱(chēng)為“米勒－抗壞血酸過(guò)氧化物酶光呼吸［4］。另外，ASC及類(lèi)囊體的質(zhì)子化作用能提高紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶（VDE）的活性，促進(jìn)了紫黃質(zhì)循環(huán)，紫黃質(zhì)循環(huán)中的紫黃質(zhì)與ABA 的合成密切相關(guān)，可見(jiàn)植物響應(yīng)逆境的氧化還原控制途徑是一個(gè)相互協(xié)調(diào)的有機(jī)整體。

植物抗氧化系統(tǒng)是近30年來(lái)植物生理學(xué)研究的熱門(mén)課題之一，目前已經(jīng)深入到分子水平。人們?cè)噲D通過(guò)基因工程手段改變或增加某種抗氧化物質(zhì)的含量，或者增強(qiáng)某種抗氧化酶的活性提高逆境條件下植物的抗氧化能力，雖然在某些植物上有一些成 功 的 例 子［5－6］，但 與 預(yù) 期 相 反 的 結(jié) 果 也 時(shí) 有 發(fā)生［7－8］。其原因是對(duì)氧化還原控制途徑缺少“宏觀”的研究，對(duì)氧化還原控制體系中的關(guān)鍵（或重要）成員缺少深入的“微觀”探究。本研究以水稻為研究材料通過(guò)基因（表達(dá)譜）芯片技術(shù)，全面了解（掃描）高鹽或低溫逆境下水稻基因組基因表達(dá)情況，根據(jù)已有的研究結(jié)論將抗氧化體系中（酶類(lèi)和非酶類(lèi)物質(zhì)）相關(guān)基因整合在一起，構(gòu)建水稻響應(yīng)高鹽和低溫逆境的氧化還原體系。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

粳稻品種‘寧粳1號(hào)’（j－NJ－1）、秈稻9311（i－93－11）為實(shí)驗(yàn)材料。選取健壯飽滿(mǎn)的種子，用1%H2O2溶液消毒。充分漂洗后28 ℃浸種48h，后于30 ℃催芽36h。待種子露白后，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的種苗播種于盛有蛭石的白瓷盤(pán)中，在植物生長(zhǎng)箱（ZSX 1000GS，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為30 ℃／22 ℃（晝／夜），光子通量密度為200μmol·m－2·s－1。培養(yǎng)過(guò)程中，每隔2d更換1次木村B 培養(yǎng)液［9］，培養(yǎng)幼苗至4葉期。然后進(jìn)行如下處理。（1）對(duì)照（CK）：水稻苗移入木村B 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃／22 ℃（晝／夜），光子通量密度為200μmol·m－2·s－1。（2）高鹽逆境（SS）：水稻苗移入含有NaCl的木村B培養(yǎng)液培養(yǎng)，NaCl濃度逐漸增加，第1、2、3天NaCl濃度分別為50、100和150 mmol／L。培養(yǎng)溫度為30 ℃／22 ℃（晝／夜），光子通量密度為200μmol·m－2·s－1。（3）低溫處理（LT）：水稻苗移入木村B培養(yǎng)液培養(yǎng)，放入植物生長(zhǎng)箱中，溫度逐漸降低，第1、2、3天的溫度分別為20℃、10℃和5℃。光子通量密度為200 μmol·m－2·s－1。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共形成3種處理。第3天，將3種處理材料于200μmol·m－2·s－1PFD 下預(yù)處理2h，然后于1 200μmol·m－2·s－1PFD 下處理5h，其它條件不變。于高光處理后0和5h取功能葉片放入液氮中，用于基因表達(dá)譜分析。

1．2 RNA樣品制備及基因芯片分析

采 用Trizol（Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA）一步法提取水稻葉片中的總RNA，通過(guò)異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進(jìn)一步采用RNeasy mini spin column 試劑盒（Qiagen，Valencia，CA，USA）對(duì)總RNA 進(jìn)行柱純化，用分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。采用NERCBBT 改良的RNA 擴(kuò)增標(biāo)記方法合成帶生物素標(biāo)記的cRNA，將純化后的cRNA 與Affymetrix公司水稻全基因組芯片（該芯片含有48 564個(gè)針對(duì)粳稻和1 260個(gè)針對(duì)秈稻基因設(shè)計(jì)的探針組）42 ℃雜交過(guò)夜，然后在芯片工作站Fluidics Station450（Affymetrix）進(jìn)行芯片洗脫，采用 芯 片 掃 描 儀Gene Chip Scanner 3000（Affymetrix）進(jìn)行掃描。這些工作均由北京博奧生物有限公司完成，每個(gè)樣品重復(fù)2次。

1．3 芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析

采用GenePix Pro 4．0圖像分析軟件（Axon Instruments公司）對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)；然后對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化；使用芯片分析軟件（Significant Analysis of Microarray，SAM）對(duì)每種樣品處理前后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)值≥2倍的變化率（處理／對(duì)照）和P≤0．05（FDR adjusted P value）。

結(jié)合MAS（Molecular Annotation System）系統(tǒng)（包括Gene Ontology Biological Process，Gene Ontology Cellular Component，Gene Ontology Molecular Function），在 線 （http：／／www．ricechip．org／）查詢(xún)相應(yīng)蛋白質(zhì)基因所對(duì)應(yīng)的Affymetrix 57K 探針組，查找這些探針組所對(duì)應(yīng)的基因芯片信號(hào)表達(dá)值，計(jì)算高鹽／低溫處理組與對(duì)照組的信號(hào)比值，把這些信號(hào)比值折算為以2為底的對(duì)數(shù)值，對(duì)這些 對(duì) 數(shù) 值 利 用Cluster 3．0 和TreeView version 1．60軟件對(duì)可重復(fù)的差異表達(dá)基因進(jìn)行Hierarchical聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 Affymetrix表達(dá)譜平臺(tái)總RNA 質(zhì)檢和芯片雜交掃描結(jié)果

采 用Trizol（Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA）一步法提取12 個(gè)水稻樣本葉片的總RNA，純化后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260，根據(jù)1OD＝40 μg／mL RNA 的關(guān)系計(jì)算得出各RNA 樣品的濃度（表1）?？俁NA 樣品進(jìn)行1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，檢查總RNA 的完整性（圖1），RNA 樣品電泳條帶清晰，28S比18SrRNA 條帶亮度接近1∶1，質(zhì)量符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 水稻葉片總RNA 瓊脂糖凝膠電泳1～12泳道編號(hào)同表1Fig．1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from leaves of rice 1－12correspond to the sequence number in Table 1

表1 Affymetrix表達(dá)譜平臺(tái)總RNA質(zhì)檢報(bào)告Table 1 Evaluation of total RNA for Affymetrix expressional profiling

12個(gè)樣本純化后cRNA 產(chǎn)物分別與12張Genechip? Rice Genome Array進(jìn)行雜交和掃描，芯片雜交掃描結(jié)果顯示高鹽低溫下，水稻基因組中所有基因表達(dá)的熒光原始信號(hào)強(qiáng)度。芯片左上角有一清晰的“GeneChip Rice”字樣，四周邊界點(diǎn)線均勻一致，四角的點(diǎn)和中間的“＋”字清晰，表明芯片質(zhì)量可靠。信號(hào)檢測(cè)報(bào)告表明，樣品各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)達(dá)到質(zhì)控要求，Oligo B2、雜交控制探針等陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)、看家基因信號(hào)值正常；平均背景值與噪音值較低；陽(yáng)性率數(shù)值正常。這些結(jié)果說(shuō)明，本組基因芯片的質(zhì)量和樣品RNA 提純質(zhì)量都很好，雜交和檢測(cè)體系亦無(wú)問(wèn)題，芯片檢測(cè)結(jié)果可靠。

2．2 脅迫下水稻葉片差異表達(dá)ROS清除酶基因

ROS清除系統(tǒng)包括清除ROS的酶類(lèi)或蛋白和抗氧化劑。清除ROS 的酶類(lèi)或蛋白有ROS 清除酶、抗氧化劑再生酶和ROS清除蛋白等3類(lèi)?？寡趸瘎┲饕锌箟难?、谷胱甘肽等［10－12］。

圖2 脅迫下水稻葉片差異表達(dá)ROS清除酶基因的微陣列譜從左到右各列依次是酶及其催化反應(yīng)、基因名稱(chēng)、基因ID和實(shí)驗(yàn)處理（J－LT，X－LT，J－SS，X－SS代碼含義同表1）；紅色代表基因表達(dá)上調(diào)，綠色代表基因表達(dá)下調(diào)，黑色代表基因表達(dá)無(wú)變化；標(biāo)尺下方數(shù)據(jù)表示基因表達(dá)量變化倍數(shù)，即處理與對(duì)照基因信號(hào)強(qiáng)度比值；圖4和圖6與此相同F(xiàn)ig．2 Microarray profile of differentially expressed genes of ROS scavenging enzymes in rice leaves under stresses The map displays the results for a given list of genes，with colour representing relative expression values（fold changes）．Columns represent enzymes and catalytic reactions，gene names（Gene symbol），Os GI code／gb，and experimental treatments（J－LT，X－LT，J－SS，X－SS，codes are the same as in Table 1）．All gene expression profiles（fold changes）were normalized for colour from red through black to green．Red indicates positive number（treatment vs．control），green indicates negative expression（repressed），and black indicates no change upon salinity or chill stress．Data below the scaleplate indicate fold change of gene expression，namely，the signal intensity ratio of expressed gene in treatment plant to expressed gene in control plant．The color scheme is the same as in Fig 4and Fig．6

ROS清除酶有超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）和過(guò)氧還蛋白（PrxR）等［13－14］，在水稻中分別由12、12、5、6 和13 個(gè)基因編碼（圖2），圖2顯示了這些基因在低溫或高鹽逆境下的差異表達(dá)微陣列譜。

圖3 差異表達(dá)ROS清除酶基因的統(tǒng)計(jì)分析Y 表示處理與對(duì)照信號(hào)強(qiáng)度比的倍數(shù)值，log2Y＞或log2Y＜－1分別表示基因上調(diào)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)水平差異顯著Fig．3 Statistical analysis of the differentially expressed genes of ROS scavenging enzymes Y represents a multiple value of processing and control signal intensity ratio；log2Y＞1or log2Y＜－1，respectively upregulated or down－regulated gene expression levels were significantly different

表2 水稻葉片差異表達(dá)的ROS清除酶基因Table 2 Differentially expressed genes of ROS scavenging enzymes in rice leaves

從圖2、表2可以看出，在粳稻和秈稻中分別檢測(cè)到19 個(gè)和12 個(gè)差異表達(dá)的ROS 清除酶基因。低溫僅誘導(dǎo)1 個(gè)SOD 基因（GenBank：Ak104160．1）的表達(dá)上調(diào)，而高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的基因涉及到ROS清除酶基因的所有種類(lèi)，如編碼CAT 的LOC＿Os02g02400和LOC＿Os06g51150基因，編碼SOD 的LOC＿Os06g05110、LOC＿Os06g02500和LOC＿Os06g02510 基 因，編 碼 APX 的LOC＿Os08g41090基因，編碼PrxR 的LOC＿Os06g42000基 因，編碼GPX的LOC＿Os03g24380基因。逆境下水稻葉片內(nèi)光呼吸增強(qiáng)，產(chǎn)生的超氧陰離子（O2）經(jīng)過(guò)下列途徑被清除：O－·2→H2O2→H2O。該途徑的第一步反應(yīng)由SOD 催化，產(chǎn)生的H2O2可被CAT、或被APX、或被GPX、或被PrxR 催化生成H2O 和其它產(chǎn)物，SOD 是ROS清除途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，CAT、APX、GPX 和PrxR 是該途徑的第二個(gè)重要酶或關(guān)鍵酶。過(guò)氧化物體參與光呼吸作用，位于過(guò)氧化物體中的APX4是ROS清除系統(tǒng)中的第二個(gè)關(guān)鍵酶，及時(shí)清除SOD 催化產(chǎn)生的H2O2，高鹽下，APX4 基因表達(dá)明顯上升。由圖3和表2還可見(jiàn)，第一，差異表達(dá)的基因數(shù)和差異表達(dá)倍數(shù)（Y 值的大?。┰诙i、粳稻之間有差異，說(shuō)明秈、粳稻對(duì)高鹽或低溫逆境的敏感性不同；第二，高鹽處理后差異表達(dá)的ROS清除酶基因數(shù)顯著多于低溫處理，說(shuō)明秈粳稻對(duì)高鹽脅迫更敏感。

2．3 脅迫下水稻葉片差異表達(dá)的抗氧化劑再生酶基因

圖4 脅迫下水稻葉片差異表達(dá)抗氧化劑再生酶基因的微陣列譜Fig．4 Microarray profile of differentially expressed genes of antioxidant regenerating enzymes in rice leaves under stresses

ROS清除系統(tǒng)中的抗氧化劑主要有抗壞血酸、谷胱甘肽等［10－12］，在清除ROS 的過(guò)程中抗壞血酸（ASC）和谷胱甘肽（GSH）等抗氧化劑脫氫而被氧化成氧化型抗氧化劑如單脫氫抗壞血酸（MDHA）、脫氫抗壞血酸（DHASC）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）等，此時(shí)需要抗氧化劑再生酶催化抗氧化劑還原。水稻葉片抗氧化劑再生酶有單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷氧還蛋白（GLR）等，分別由5個(gè)、3個(gè)、4個(gè)和36個(gè)基因編碼（圖4）。從圖4和圖5可知，低溫對(duì)秈粳稻葉片MDHAR 基因、DHAR基因和GR 基因表達(dá)影響小，僅誘導(dǎo)極少數(shù)GLR 基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。例如，經(jīng)低溫處理后粳稻葉片中，僅有一個(gè)編碼GLR 基因表達(dá)下調(diào)，無(wú)表達(dá)上調(diào)相關(guān)基因；秈稻中有2個(gè)編碼GLR 基因表達(dá)上調(diào)，分別是LOC＿Os12g35340和LOC＿Os01g27140基因，無(wú)相關(guān)表達(dá)下調(diào)基因。高鹽脅迫可誘導(dǎo)秈粳稻許多抗氧化劑再生酶基因的表達(dá)變化，包括MDHAR 基 因、DHAR 基 因、GR 基 因 和GLR 基因。經(jīng)高鹽脅迫后粳稻中有7個(gè)表達(dá)上調(diào)的抗氧化劑再生酶基因，9個(gè)表達(dá)下調(diào)的相關(guān)基因；秈稻中有11個(gè)表達(dá)上調(diào)相關(guān)基因和6個(gè)表達(dá)下調(diào)的相關(guān)基因，其中3 個(gè)GLR 基因（LOC＿Os01g09830，LOC＿Os12g35340和LOC＿Os01g27140）值得關(guān)注（表3）。LOC＿Os01g09830基因在J－LT、X－LT、J－SS、X－SS等4 個(gè)處理中均下調(diào)表達(dá)，其Y 比值分別為0．44、0．59、0．08和0．16，說(shuō)明高鹽或低溫逆境都會(huì)抑制這個(gè)基因的表達(dá)。LOC＿Os12g35340基因僅在秈稻高鹽或低溫處理（X－LT，X－SS）中表達(dá)上調(diào)，其Y 值分別為4．14和5．05，而在粳稻高鹽或低溫處理（J－LT，J－SS）中表達(dá)水平無(wú)顯著變化。LOC＿Os01g27140基因在秈稻低溫處理（X－LT）或高鹽處理（X－SS）下表達(dá)均上調(diào)，其表達(dá)變化值Y 分別為2．79和41．42，而在粳稻低溫（J－LT）處理下，表達(dá)沒(méi)有變化，其Y值為0．98，而粳稻高鹽（J－SS）處理下表達(dá)上調(diào)，其Y 值為11．45，體現(xiàn)了秈粳稻對(duì)高鹽或低溫逆境的敏感性差異。

圖5 差異表達(dá)抗氧化劑再生酶基因的統(tǒng)計(jì)Fig．5 Statistical analysis of the differentially expressed genes of antioxidant regenerating enzymes

表3 水稻葉片差異表達(dá)的抗氧化劑再生酶基因Table 3 Differently expressed genes of antioxidant regenerating enzymes in rice leaves

表4 水稻葉片差異表達(dá)的ROS清除蛋白基因Table 4 Differently expressed genes of ROS scavenging proteins in rice leaves

圖6 脅迫下水稻葉片差異表達(dá)ROS清除蛋白基因的微陣列譜Fig．6 Microarray profile of differentially expressed genes of ROS－scavenging proteins in rice leaves under stresses

2．4 脅迫下水稻葉片差異表達(dá)的ROS清除蛋白基因

ROS清除蛋白和酶類(lèi)主要有鐵蛋白（Ferritin）、銅藍(lán)蛋白（blue copper protein，BCP）、交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）和硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）等，分別由2、20、5 和64個(gè)基因編碼，共91個(gè)基因（圖6）。從圖6和圖7 可知，低溫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)或表達(dá)下調(diào)的ROS清除蛋白基因，粳稻中7個(gè)、秈稻中3個(gè)，分別占總數(shù)（91）的7．7%和3．3%。高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)或表達(dá)下調(diào)的ROS清除蛋白基因，粳稻中19個(gè)、秈稻中17個(gè)，分別占總數(shù)（91）的20．9%和18．7%?？梢?jiàn)，低溫逆境對(duì)秈粳稻葉片ROS清除蛋白基因表達(dá)水平的影響小，而高鹽脅迫的影響非常明顯，這一點(diǎn)與ROS清除酶基因的表達(dá)特性相似。上述高鹽或低溫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)或表達(dá)下調(diào)的基因中有兩組基因值得關(guān)注（表4）。第一組是高鹽脅迫或低溫逆境都能誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的基因LOC＿Os08g37660和LOC＿Os07g48510，在JLT、X－LT、J－SS、X－SS處理中LOC＿Os08g37660基因的表 達(dá) 倍 數(shù) 值Y 分 別 是7．93、4．43、1．57 和2．63，LOC＿Os07g48510基因的表達(dá)倍數(shù)值Y分別是2．35、1．65、23．42和12．82，該8 個(gè)數(shù)據(jù)中盡管有2個(gè)數(shù)據(jù)（1．57和1．65）未達(dá)到2倍，但能體現(xiàn)基因表達(dá)是上調(diào)的。換言之，無(wú)論在高鹽脅迫或低溫逆境條件下基因LOC＿Os08g37660 和LOC＿Os07g48510都能發(fā)揮重要作用，這為今后進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。第二組是僅在高鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)的基因，LOC＿Os04g51160、LOC＿Os08g29110、LOC＿Os01g61320和LOC＿Os02g53400共4個(gè)基因，在粳稻中它們的表達(dá)倍數(shù)Y 值分別是3．60、2．61、7．76和15．52，在秈稻中它們的表達(dá)倍數(shù)Y 值分別是2．68、3．61、17．50和85．05，它們的表達(dá)倍數(shù)Y 值高或非常高。LOC＿Os04g51160 編碼AOX 蛋白，LOC＿Os08g29110、LOC＿Os01g61320 和LOC＿Os02g53400編碼TRX 蛋白，它們?cè)谒卷憫?yīng)高鹽脅迫過(guò)程中有重要作用。

圖7 差異表達(dá)ROS清除蛋白基因的統(tǒng)計(jì)分析Fig．7 Statistical analysis of the differentially expressed genes of ROS－scavenging proteins

圖8 水稻葉細(xì)胞內(nèi)ROS清除途徑的分布Fig．8 Distribution of ROS－scavenging pathways in rice leaves

2．5 水稻葉細(xì)胞內(nèi)各區(qū)室的ROS清除途徑

植物各細(xì)胞區(qū)室中幾乎都存在多種ROS清除酶，且每一區(qū)室的不同種類(lèi)ROS均有多種清除酶。葉綠體類(lèi)囊體通過(guò)“水－水循環(huán)”通路清除O－·2和H2O2，葉綠體基質(zhì)中ROS主要由基質(zhì)SOD 及抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)來(lái)清除。此外，PrxR 和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）也參與基質(zhì)H2O2的清除。過(guò)氧化物酶體中，SOD、CAT 及APX 負(fù)責(zé)分解光呼吸和脂肪酸氧化產(chǎn)生的ROS。線粒體中同樣存在SOD、AOX 及抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)。胞質(zhì)酶促系統(tǒng)與葉綠體基質(zhì)基本一致，但兩者編碼這些酶的基因卻不同。

根據(jù)芯片雜交結(jié)果、MAS（molecular annotation system）系統(tǒng)（包括Gene Ontology Biological Process，Gene Ontology Cellular Component，Gene Ontology Molecular Function）分析得出的結(jié)論，共獲得了187個(gè)相關(guān)基因，由這些基因產(chǎn)物（酶）所參加的生化反應(yīng)構(gòu)建成水稻葉細(xì)胞內(nèi)ROS清除途徑的分布圖（圖8），主要闡明以下兩個(gè)方面的原則。第一，基因表達(dá)的機(jī)動(dòng)性?；虮磉_(dá)的機(jī)動(dòng)性主要表現(xiàn)在對(duì)不同逆境脅迫的響應(yīng)，同一個(gè)基因?qū)Σ煌哪婢秤胁煌捻憫?yīng)，或在相同的逆境下相似功能的一組基因有不同的響應(yīng)等。例如，水稻Fe－SOD基因（LOC＿Os06g05110）低溫脅迫5h后其表達(dá)略有上調(diào)（統(tǒng)計(jì)不顯著），但經(jīng)高鹽脅迫5h后，其表達(dá)上調(diào)約10倍。又如，在相同的脅迫條件下（如高鹽脅迫5h后），MDHAR（LOC＿Os08g05570）基因表達(dá)上調(diào)2．9倍，而另一個(gè)MDHAR基因（LOC＿Os09g39380）的表達(dá)量無(wú)顯著變化。第二，基因或功能蛋白的冗余性。水稻響應(yīng)高鹽／低溫脅迫的氧化還原控制網(wǎng)絡(luò)包括SOD、APX、PrxR、GPX、CAT 和Trx等抗氧化酶，非酶促抗氧化劑GSH、ASC、類(lèi)胡蘿卜素等，GSH氧化為GSSG、ASC 氧化為MDHA 或DHA，這些非酶促抗氧化劑構(gòu)建了細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原緩沖體系。由這些抗氧化酶、非酶促抗氧化劑組成的氧化還原途徑具有部分疊加功能，因此，不同氧化還原途徑之間有補(bǔ)償功能，即功能冗余，例如，維生素E缺失的擬南芥突變體中，ASC 和GSH 的含量增加［14］。冗余是生命進(jìn)化過(guò)程中自然選擇賦予的一種固有特性，也是生命有機(jī)體減少外界環(huán)境變化對(duì)其生存影響的保險(xiǎn)對(duì)策，對(duì)于生命系統(tǒng)具有重大意義。基因間功能的冗余性就好像細(xì)胞為其生化活動(dòng)的參與因子做了一個(gè)備份，一旦某個(gè)基因發(fā)生異常變化甚至失活，與其冗余的“備份基因”就會(huì)激活且發(fā)揮功能性作用，使得細(xì)胞整體的生命活動(dòng)得以維系，而這也正是自然選擇賦予生命進(jìn)化的普適策略。

3 討 論

3．1 氧化還原調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)酶的協(xié)同作用

雖然細(xì)胞不同區(qū)室中的ROS清除路徑相互分離，但H2O2等ROS 極 易 跨 膜 擴(kuò) 散［12］，且 抗 壞 血酸、谷胱甘肽等小分子抗氧化劑能在細(xì)胞不同區(qū)室間跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)［13］，因而細(xì)胞各區(qū)室的清除酶之間是相互協(xié)同作用的。對(duì)擬南芥的研究表明，ROS清除網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞不同區(qū)室間的協(xié)同作用模式非常復(fù)雜，一般認(rèn)為強(qiáng)光脅迫導(dǎo)致葉綠體或過(guò)氧化物酶體中ROS的過(guò)量產(chǎn)生，推測(cè)強(qiáng)光脅迫也可能誘導(dǎo)葉綠體中清除酶類(lèi)基因的表達(dá)，但實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光脅迫誘導(dǎo)的是細(xì)胞質(zhì)而非葉綠體中清除酶類(lèi)基因的表達(dá)［15］。另外，植物體中至少有3 種ROS 清除酶基因可同時(shí)在葉綠體及線粒體中表達(dá)［16－17］，說(shuō)明這兩個(gè)細(xì)胞器間具有高度協(xié)同的防御應(yīng)答機(jī)制。

3．2 葉綠體是氧化還原調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的起點(diǎn)及終點(diǎn)

基于O2分子的化學(xué)性質(zhì)、還原力需求狀態(tài)以及多余光合電子帶來(lái)的危害，葉綠體作為光合作用的場(chǎng)所與其它細(xì)胞器相比更易遭受氧化脅迫的傷害。葉綠體有多種ROS清除系統(tǒng)，至少包括2條完整的H2O2清除通路，即類(lèi)囊體中的“水－水循環(huán)”和基質(zhì)中的“抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)”。在葉綠體中，H2O2和O－·2的產(chǎn)生與SOD、APX、CAT 等ROS清除酶的活性間存在動(dòng)態(tài)平衡［18］。水稻至少有4種不同的葉綠體APX，即結(jié)合類(lèi)囊體膜的APX8（LOC＿Os02g34810）、基質(zhì)APX5（LOC＿Os12g07830）、基質(zhì)APX6（LOC＿Os12g07860）、基 質(zhì) APX7（LOC＿Os04g35520）。而SOD在水稻葉綠體中有2種不同形式，即Cu／Zn－SOD（LOC＿Os08g44770）和Fe－SOD（LOC＿Os06g05110）。葉綠體抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)中還存在另外一些清除酶。葉綠體中還有大量抗壞血酸及谷胱甘肽等抗氧化劑的存在，以還原或重新合成被氧化的生物分子。光照下葉綠體需重新修復(fù)被氧化的代謝物質(zhì)，該過(guò)程對(duì)還原力的需求主要由光合電子傳遞鏈提供。伴隨光氧化脅迫的增強(qiáng)，幾乎全部光合電子被傳遞到抗氧化防御系統(tǒng)以提供還原力、增強(qiáng)抗氧化脅迫的能力［18］?，F(xiàn)有報(bào)道表明，葉綠體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由質(zhì)體醌、硫氧還蛋白系統(tǒng)的氧化還原狀態(tài)、四吡咯（tetrapyrroles）、碳水化合物及脫落酸等誘發(fā)，并進(jìn)一步調(diào)控抗氧化酶和氧化還原調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，從而說(shuō)明葉綠體是氧化還原調(diào)控中的起點(diǎn)及終點(diǎn)［19］。

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