余曉娟，袁 月，王繼源，陶建敏

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，南京210095）

植物雄性不育是一種植物在有性繁殖過程中雄性器官發(fā)育由于受到某些內(nèi)、外因素的影響不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子體的遺傳現(xiàn)象。雄性不育在植物界中很常見，迄今為止已在43 科，162屬的320種植物中發(fā)現(xiàn)617例天然的或種屬間雜交來源的雄性不育［1］。過去關(guān)于植物雄性不育的研究主要集中在水稻、高粱、小麥等農(nóng)作物以及一些草本植物方面，對于多年生木本植物雄性不育的研究相對 較 少，主 要 有 杉 木［2－3］、桃［4－7］、棗［8］、芒 果［9］、板栗［10－12］、梨［13－15］等，關(guān) 于 葡 萄 雄 性 不 育 的 研 究 主 要有雄性不育種質(zhì)特性研究［16］、不育種質(zhì)生理生化分析［17－18］以及雄性不育基因的定位［19］、克隆［20］。

半不育現(xiàn)象在1921年就有發(fā)現(xiàn)，Terao［21］在水稻品種“Sekiyama”中發(fā)現(xiàn)了1 株半不育突變株，1995 年 在“Nakate－shinsenbon”品 種 和“Nippon bare”品種中也發(fā)現(xiàn)了半不育突變體，突變率分別為1．68×10－4、8．52×10－5［22］。但是關(guān)于其半不育特性及其發(fā)生原因的研究較少，Zhou 等［23］觀察了“Nippon bare”水稻的后代半不育突變體w207－2的花粉形態(tài)及其不育特性，并從中克隆了Pollen Semi－Sterility1基因。目前，在果樹上半不育的相關(guān)研究還尚未見報道。

絨氈層位于小孢子母細胞和花藥壁體細胞之間，廣泛存在于陸生植物中并為孢子體母細胞、小孢子、花粉粒提供必需的營養(yǎng)，因此有著相當大的生理意義［24］。絨氈層的發(fā)育是一個復(fù)雜而精密的細胞行為，而且是在極短時間內(nèi)接連完成，其中涉及到了大量基因的特異性表達，目前大多數(shù)的花粉敗育都與絨氈層的異常活動有關(guān)系。Zhu等［25］對擬南芥絨氈層形成、發(fā)育和功能必不可少的8個調(diào)控基因進行分析，假設(shè)了一個絨氈層發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在這個絨氈層發(fā)育轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)中，DYT1 處于SPL／NZZ 和EMS1／EXS 的下游，在絨氈層細胞命運決定后調(diào)控絨氈層的發(fā)育，這也符合該基因在絨氈層分化與發(fā)育過程中的先后表達順序，TDF1 位于DYT1的下游，對絨氈層向分泌型態(tài)的轉(zhuǎn)化起到重要作用。AtMYB103／MS188 處于TDF1 下游，調(diào)控絨氈層后期的發(fā)育與花粉壁形成。

本試驗的研究對象是從‘魏可’（可育）葡萄自交后代中選育出來的單株，‘魏可’實生種子于2008年播種，2011、2012年開花、結(jié)果過程中發(fā)現(xiàn)部分單株表現(xiàn)出類似于雄性不育的異常表現(xiàn)。對花器官外部形態(tài)觀察、活力測定及花粉粒形狀進行觀察以及細胞層次分析，并對絨氈層發(fā)育的關(guān)鍵相關(guān)基因進行了表達分析，為進一步探討其半不育產(chǎn)生的原因及分子機理提供基本依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 試驗材料

葡萄品種‘魏可’（可育）（V．vinifera L．cv．Wink）、‘鐘山紅’（雄性不育）以及2個‘魏可’自交后代單株‘魏可實生－3’、‘魏可實生－12’。

1．2 方 法

1．2．1 花粉外部形態(tài)觀察 于盛花期采集上述材料的花蕾，將采集的新鮮花蕾于體式顯微鏡（MoticK－400L）下拍照，觀察花器官外觀形態(tài)。

1．2．2 花粉生活力測定 花前1周將花序套袋，初花期采集花蕾，取下花藥于培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)24 h，收集花粉放入指形管中，干燥后置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｈ〉蜏貤l件下保存的花粉采用離體萌發(fā)法［26］測 定 其 花 粉 生 活 力，滴1 滴 萌 發(fā) 培 養(yǎng) 基（0．01%的硼酸、10%的蔗糖和1%的瓊脂）于載玻片上，待其冷卻后，將花粉均勻散播于培養(yǎng)基表面，25～30 ℃培養(yǎng)24h萌發(fā)。在光學(xué)顯微鏡（Olympus BX－532083）下觀測萌發(fā)情況，統(tǒng)計5個視野下總共300?；ǚ鄣拿劝l(fā)率，花粉管長度大于花粉粒直徑的視為萌發(fā)。

1．2．3 花粉粒形態(tài)的觀察 取初花期的花粉粘于雙面膠上，經(jīng)過處理后噴金鍍膜（日立E－1010離子濺射儀），在掃描電子顯微鏡（日立S－3000N 型）下觀察拍照。參照牛立新等［27］應(yīng)用標準差法統(tǒng)計花粉粒的大小及形態(tài)。

1．2．4 花藥及小孢子細胞學(xué)觀察 從幼蕾期到初花期，分別采集上述材料的花蕾，每4d采樣1次，用于小孢子細胞學(xué)觀察。不同品種不同發(fā)育時期的花粉用FAA 分別固定，4 ℃保存。采用石蠟切片技術(shù)，厚度6～8μm，鐵礬－蘇木精染色，固綠復(fù)染，中性樹膠封固［28－29］，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 The primers for qRT－PCR

1．2．5 基因表達分析 采用改良CTAB法 提取葡萄各個發(fā)育時期的花蕾的RNA，第一鏈cDNA的合成參照Prime ScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）操 作 說 明 書。cDNA 稀 釋10倍后，取1μL 用于表達分析。熒光定量RT－PCR分析以Actin 為內(nèi)參基因，在NCBI上根據(jù)擬南芥DYT1、TDF1、MYB103基因，查找葡萄中相似性最高的序列，表達分析所用引物見表1，反應(yīng)體系為稀釋10×的cDNA 1μL，上下游引物分別為0．2μL，SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μL，ddH2O 8．6 μL。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性4min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20s，72 ℃延伸40s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用7300system 軟件和2－△△Ct的方法。

2 結(jié)果與分析

2．1 花粉外部及花藥形態(tài)觀察

與‘魏可’相比，‘魏可實生－3’、‘魏可實生－12’開花后雄蕊花絲表現(xiàn)出不同程度的卷曲?！娚郊t’是雌能花品種，其花絲短、花藥翻卷［31］。‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’花絲卷曲但并未翻卷，花絲短于花柱?！嚎伞幕ㄋ幹泻休^多的花粉，‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’的花粉含量較少（圖1，A～H）。

2．2 花粉生活力鑒定

‘魏可’花粉的萌發(fā)率約為70%，‘魏可實生－3’、‘魏可實生－12’的花粉萌發(fā)率都為10%左右，萌發(fā)率明顯低于‘魏可’，只具有一定的萌發(fā)能力，‘鐘山紅’的花粉無萌發(fā)力（圖2，A～D）。

2．3 花粉粒形態(tài)觀察

‘魏可’花粉粒為長球形，外壁為孔穴狀紋飾，中間分布稀少，兩端較為密集（圖2，E）；‘鐘山紅’花粉粒為近球形，花粉外壁為網(wǎng)狀及其他不規(guī)則狀紋飾（圖2，6），‘魏可’實生單株包含有長球形花粉粒、近球形花粉粒以及極度變形的花粉粒，長球形花粉粒與‘魏可’外形極為相似（圖2，G、H 所示正常的花粉粒）；‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’部分變形花粉粒與‘鐘山紅’相似（圖2，G、H 所示異常的花粉粒）。

2．4 花藥和小孢子主要發(fā)育時期的細胞學(xué)觀察

葡萄含有4～5枚雄蕊，每個花藥由4個花粉囊和藥隔構(gòu)成，從‘魏可’花藥的橫切面上可看到正?；ㄋ幱苫ǚ勰冶诤托℃咦幽讣毎M成，花粉囊壁由表皮層、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層組成，圍繞著中央的花粉母細胞（圖版Ⅰ，1）；小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂后，包圍四分體的胼胝質(zhì)降解，單核小孢子游離出來，剛游離出來的小孢子排列稀松且不規(guī)則，小孢子細胞質(zhì)較濃，細胞核位于中央，絨氈層開始降解，細胞變薄變扁平，藥室內(nèi)壁增厚（圖版Ⅰ，2）；小孢子逐漸發(fā)育，體積變大，大部分細胞核從中央移至細胞一側(cè)，稱為單核早期或單核靠邊期，此時，表皮細胞逐漸變得扁平，藥室內(nèi)壁細胞切向伸長，呈纖維狀排列，絨氈層細胞逐漸降解（圖版Ⅰ，3）；之后小孢子的細胞核進行有絲分裂，生成2個核，呈心形凹陷，形成2個細胞，即生殖細胞和營養(yǎng)細胞，此時期，雙核花粉粒積累營養(yǎng)物質(zhì)，染色較深，絨氈層顯著解體，核消失，內(nèi)含物消失（圖版Ⅰ，4）；花粉成熟時期，‘魏可’花粉粒形態(tài)均勻一致，染色深，之后兩相鄰的藥室相連，藥室開裂，散出花粉（圖版Ⅰ，5）。

圖2 花粉萌發(fā)及花粉粒掃描電鏡和透射電鏡分析A～D分別為魏可、魏可實生－3、魏可實生－12和鐘山紅花粉萌發(fā)狀況；E～H 分別為魏可、鐘山紅、魏可實生－3和魏可實生－12成熟花粉的掃描電鏡圖；紅色箭頭為正?；ǚ?；白色箭頭為異常花粉Fig．2 The appearance ofgermination of pollen tube and scanning electron microscope（SEM）images of the mature pollens from grape A－D represent Wink，Wink seedling－3，Wink seedling－12and Zhongshanhong germination of pollen tube，respectively；E－H represent SEM image of the mature pollen grain fromWink，Zhongshanhong，Wink seedlin－3and Wink seedlin－12，respectively；Red arrows stand for normal pollen；White arrows stand for abnormal pollen．

‘魏可實生－3’花粉囊壁由表皮層、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層組成，但結(jié)構(gòu)層次不明顯，圍繞著中央的小孢子細胞，小孢子母細胞稀少、疏松（圖版Ⅰ，6）；小孢子母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂后形成四分體，但從四分體游離出來的小孢子含量少，部分四分體的胼胝質(zhì)不降解，小孢子不能正常游離出來，中層細胞已變成薄層，絨氈層細胞未降解，染色深（圖版Ⅰ，7）；單核靠邊期，表皮細胞變扁平，藥室內(nèi)壁細胞纖維狀排列，但絨氈層才開始降解（圖版Ⅰ，8）；雙核期，絨氈層細胞未完全降解，花粉囊中出現(xiàn)空殼花粉（圖版Ⅰ，9）；花粉成熟時，花粉粒大小不一，染色不均勻，絨氈層并沒有降解完全，將花粉包圍，花粉無法正常散出（圖版Ⅰ，10）。

‘魏可實生－12’花藥同樣具有表皮層、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層結(jié)構(gòu)，但結(jié)構(gòu)不明顯，花粉母細胞位于中央（圖版Ⅰ，11）；小孢子母細胞形成四分體后，能夠正常釋放小孢子，絨氈層細胞已大部分降解，說明‘魏可實生－12’絨氈層細胞在小孢子釋放前已經(jīng)開始降解（圖版Ⅰ，12）；單核靠邊期，表皮細胞、藥室內(nèi)壁細胞正常發(fā)育，絨氈層細胞顯著降解，還存在空殼花粉粒（圖版Ⅰ，13）；小孢子細胞有絲分裂進入雙核期，絨氈層幾乎完全降解成薄層，花粉囊中含有空殼、染色較淺的花粉粒（圖版Ⅰ，14）；花粉成熟期，絨氈層消失，花粉囊中花粉粒大小不一，染色淺，而且還存在空殼花粉粒（圖版Ⅰ，15）。

圖3 絨氈層發(fā)育相關(guān)基因的表達分析Ⅰ．減數(shù)分裂期；Ⅱ．單核早期；Ⅲ．單核晚期；Ⅳ．雙核期；Ⅴ．成熟花粉期Fig．3 Expression analysis of the tapetum development related geneⅠ．Meiosis stage；Ⅱ．Mononuclear microspore stage；Ⅲ．Late mononuclear microspore stage；Ⅳ．Binuclear stage；Ⅴ．Mature stage

在‘魏可實生－12’的部分花藥中發(fā)現(xiàn)不分化的細胞團，沒有藥室內(nèi)壁、中層及絨氈層的分化，沒有小孢子母細胞的形成，也沒有小孢子的發(fā)生和發(fā)育（圖版Ⅰ，16、17），試驗中還發(fā)現(xiàn)沒有花粉的空花粉囊，不具有可育花藥的藥室結(jié)構(gòu)（圖版Ⅰ，18）?！嚎蓪嵣?’和‘魏可實生－12’并不是所有的小孢子都發(fā)育異常，還有少部分小孢子能夠正常發(fā)育，最終形成正常的成熟花粉粒（圖版Ⅰ，19、20）。

2．5 絨氈層發(fā)育相關(guān)基因的表達分析

圖3所示，在減數(shù)分裂期，‘魏可’的絨氈層發(fā)育相關(guān)基因DYT1、TDF1 表達量均最高，MYB4 最低，‘鐘山紅’的3個基因的表達情況與‘魏可’相反，‘魏可實生－3’‘和‘魏可實生－12’的表達水平均在‘魏可’與‘鐘山紅’之間；單核早期開始到花粉成熟，3個基因在‘魏可’中的表達水平一直均較低，‘鐘山紅’的DYT1 基因表達量一直最高，TDF1、MYB4基因表達水平一直最低，‘魏可實生－3’TDF1 基因在單核早期表達量最高，MYB4基因在單核晚期表達量最高，‘魏可實生－12’的TDF1基因在雙核期表達量最高，MYB4基因表達水平一直最低。

3 討 論

3．1 ‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’半不育特性的分析

‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’雄蕊花絲卷曲，花藥中花粉量少，花粉萌發(fā)率僅10%左右，花粉存在2種形態(tài)，一種為正常長球形，含有萌發(fā)溝，另一種為異常近球形，不含萌發(fā)溝。正?；ǚ叟c‘魏可’（可育）形態(tài)相似，異?；ǚ叟c‘鐘山紅’（雄性不育）［31］相似，根 據(jù) 牛 立 新 等［27］、賀 普 超［32］對 葡 萄 雄性不育的描述，屬于葡萄雄性不育類型。按照賀和初等［33］（水稻）對花粉育性的劃分，‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’花粉萌發(fā)率10%左右，屬半不育花粉，按照Raj等［34］的劃分標準，屬于部分不育花粉。

周時榮［35］研究發(fā)現(xiàn)w207－2半不育是由于Os－Kinesin－1基因中一個單堿基的突變造成了其編碼的驅(qū)動蛋白中的一個與微管結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸的改變，進而導(dǎo)致其不能正常地參與減數(shù)分裂過程中涉及染色體運動的聯(lián)會、分離等過程，造成部分花粉缺失1條或多條染色體，并在單核期逐漸開始退化為沒有任何內(nèi)容物的空殼花粉，最終形成了花粉的半不育?！嚎蓪嵣?’和‘魏可實生－12’是‘魏可’自交后代性狀分離得到的單株，小孢子細胞切片觀察到‘魏可實生－3’在花粉成熟期仍有絨氈層包圍，部分花粉粒異常，‘魏可實生－12’的絨氈層則在單核早期就大部分降解，單核晚期觀察不到明顯的絨氈層，最終藥室內(nèi)出現(xiàn)異?；ǚ郏@可能是基因調(diào)控導(dǎo)致絨氈層發(fā)育異常，最終不能為花粉發(fā)育提供足夠的營養(yǎng)，導(dǎo)致部分花粉不育。

3．2 ‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’小孢子敗育的時期和原因分析

不同種植物、同一種植物不同品種雄性不育的敗育機理都不盡相同，在花粉發(fā)育的所有階段都可能發(fā)生敗育，單子葉植物多數(shù)在單核至雙核期，雙子葉植物多發(fā)生在四分體至小孢子形成期［36］。目前大多數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)植物絨氈層發(fā)育不正常是導(dǎo)致花粉敗育的一個主要原因。絨氈層是藥室壁的最內(nèi)層，包圍著小孢子，在花粉形成和發(fā)育中起重要的作用：產(chǎn)生和輸送給小孢子正常發(fā)育所需的酶類、激素類和營養(yǎng)物質(zhì)；合成胼胝質(zhì)酶，分解包圍在四分體周圍的胼胝質(zhì)壁；提供構(gòu)成花粉外壁的孢粉素。絨氈層發(fā)育和降解的異常，往往會影響小孢子的正常發(fā)育，有研究［37］認為花粉敗育是由于絨氈層細胞在花粉形成和發(fā)育過程過度肥大液泡化、提前或延后退化。

本研究中‘魏可實生－3’、‘魏可實生－12’沒有明顯的藥室壁結(jié)構(gòu)，小孢子母細胞稀少、疏松，這可能與早期原生造孢細胞和平周細胞的分化異常有關(guān)［38］?！嚎蓪嵣?’雙核期絨氈層未完全降解，一直到花粉成熟期還存在，包圍著成熟的花粉粒，絨氈層細胞中的營養(yǎng)滯留其中，沒有及時供應(yīng)小孢子的發(fā)育，引起后期小孢子的敗育，部分花粉粒異常?！嚎蓪嵣?2’絨氈層細胞在單核早期就大部分降解，過早降解導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)異常，部分小孢子敗育，這與劉倩等［16］在‘鐘山紅’小孢子發(fā)育的單核早期觀察到的現(xiàn)象一致。

本研究中還發(fā)現(xiàn)沒有花粉的空花粉囊（圖版Ⅰ，17），羅來水等［6］對桃樹23個品種花粉發(fā)生發(fā)育和花粉敗育過程中細胞形態(tài)學(xué)上的變化特征研究，發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，指出在花粉處于單核晚期－二核早中期絨氈層細胞發(fā)生液化、增生現(xiàn)象和花粉母細胞減數(shù)分裂不正常是導(dǎo)致大多數(shù)桃樹品種產(chǎn)生空?；ǚ鄣闹饕?。但本研究中‘魏可實生－12’小孢子發(fā)育的單核晚期－二核早期中并未觀察到絨氈層液化、增生現(xiàn)象，空花粉囊可能是因為絨氈層提前解體，無法正常分泌胼胝質(zhì)酶，小孢子很難從四分體中游離出來，而且絨氈層細胞中營養(yǎng)物質(zhì)流失，無法為小孢子正常發(fā)育提供營養(yǎng)。

3．3 ‘魏可實生－3’和‘魏可實生－12’絨氈層發(fā)育異常的基因調(diào)控分析

DYT1（DYSFUNCTIONAL TAPETUM1）編碼一個在花藥發(fā)育早期表達的basic helix－loop－h(huán)elix（bHLH）家族轉(zhuǎn)錄因子，控制著絨氈層特異基因的表達，在花藥發(fā)育前期的絨氈層中強烈表達，DYT1突變體絨氈層細胞出現(xiàn)異常的空泡化和肥大，無法轉(zhuǎn)為分泌型細胞，導(dǎo)致小孢子提前降解，完全 雄 性 不 育［39］；TDF1（DEFECTIVE IN TAPETAL DEVELOPMENT）是一個在絨氈層、花粉母細胞和小孢子中強烈表達的MYB 家族的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控了絨氈層細胞的分裂以及正常的分泌功能，是控制胼胝質(zhì)解體的重要元件，tdf1突變體表型類似于dyt1，絨氈層細胞無法進一步分化為分泌型的細胞，不能正常分泌胼胝質(zhì)酶，最后胼胝質(zhì)無法降解使 小 孢 子 聚 集 在 花 粉 囊 中，完 全 敗 育［40］；At－MYB103在擬南芥絨氈層中特異性表達并對絨氈層功能起重要作用，編碼MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子，其突變體atmyb103花藥發(fā)育過程中絨氈層提早降解和花粉 畸形［41］，葡 萄 中 的MYB4 基 因 是AtMYB103 的同源基因，均屬于MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族，具有相同的結(jié)構(gòu)功能域。

本研究中，從‘鐘山紅’單核早期到花粉成熟，DYT1基因的表達水平一直較高，它的過量表達抑制了下游TDF1基因的表達，進而導(dǎo)致了下游MYB4基因減數(shù)分裂期超量表達，從而影響絨氈層發(fā)育，‘鐘山紅’絨氈層提前降解［16］；‘魏可實生－3’DYT1基因在減數(shù)分裂期表達量遠低于‘魏可’，TDF1基因在單核早期表達量最高，DYT1基因表達量不足抑制下游TDF1基因在減數(shù)分裂期的表達，而TDF1基因單核早期的過量表達導(dǎo)致下游MYB4基因在單核早期表達量異常增加，導(dǎo)致絨氈層延遲降解；‘魏可實生－12’DYT1基因在減數(shù)分裂期表達量低于‘魏可’，DYT1基因減數(shù)分裂期的表達量不足導(dǎo)致了TDF1基因在雙核期、花粉成熟期過量表達，最終下游MYB4基因過量表達，絨氈層提前降解。同時TDF1基因還是控制胼胝質(zhì)解體的重要元件，TDF1異常表達不僅會影響絨氈層降解，而且還會影響絨氈層分泌胼胝質(zhì)酶，導(dǎo)致胼胝質(zhì)壁無法正常解體，進而影響小孢子的釋放，‘魏可實生－12’觀察到的空花粉囊可能與TDF1基因雙核期過量表達有關(guān)。DYT1、TDF1、MYB4基因編碼蛋白調(diào)控絨氈層發(fā)育的具體作用機理還有待 于進一步研究探討。

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圖版Ⅰ 魏可實生－3和魏可實生－12花藥和小孢子發(fā)育觀察E．表皮層；En．室內(nèi)壁；ML．中層；T．絨氈層；Td．四分體；PMC．花粉母細胞（小孢子母細胞）；PG．花粉粒1～15．花藥和小孢子發(fā)育過程：1～5．魏可；6～10．魏可實生－3；11～15．魏可實生－12；16、17．魏可實生－12未發(fā)育的孢原細胞團；18．魏可實生－12空花粉囊；19．魏可實生－3成熟花粉粒（正常）；20．魏可實生－12成熟花粉粒（正常）。PlateⅠ The results of anther and microspores development E．Epidermis；En．Endothecium；ML．Middle layer；T．Tapetum；Td．Tetrad；PMC．Microspore mother cell；PG．Pollen grain Fig．1－15．The development of anthers and microspores：Fig．1－5．Wink；Fig．6－10．Wink seedling－3；Fig．11－15．Wink seedling－12；Fig．16，17．Wink seedling－12undeveloped archesporial cell；Fig．18．Wink seedling－12empty anther；Fig．19．Wink seedling－3 mature pollen grains（normal）；Fig．20．Wink seedling－12mature pollen grains（normal）．