戴照義 王運強 劉志雄 郭鳳領(lǐng) 焦春海 邱正明

摘 要： 對88份來源不同的西瓜種質(zhì)資源，采用37個表型性狀和22對SSR分子標記進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：表型性狀變異主要體現(xiàn)在果實形狀、品質(zhì)和葉片等性狀上，第1、第2、第3主成分的方差貢獻率分別為13.6%、11.8%和9.0%，前3個主成分的累計為34.4%，依據(jù)表型性狀進行聚類分析，在歐氏距離15.0時，可將材料分成2類，在歐氏距離13.5時，可將材料分為3類；SSR分子標記共擴增出的55個多態(tài)性位點，平均多態(tài)性信息含量為0.41，利用UPGMA法進行聚類分析，88份西瓜種質(zhì)可以被分為4個組。第1、第2、第3主坐標的方差貢獻率分別為22.8%、10.8%和9.1%，前3個主坐標累計為42.7%。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 種質(zhì)資源； 遺傳多樣性； 表型性狀； SSR分子標記

Abstract： Genetic diversity of 88 accessions watermelon germplasm resources were analyzed using 37 phenotypic characters and 22 simple repeat sequences（SSR） molecular markers. The results showed that the variations in fruit shape，quality and leaf were the main sources of variations in phenotypic characters. The variance contribution of the first three principle components were 13.6%，11.8% and 9.0%，cumulative proportion was 34.4%. According to the cluster analysis of the phenotypic characters，the watermelon germplasm resources were divided into 2 categories at euclidean distance of 15.0，and 3 categories at euclidean distance of 13.5. The SSR molecular markers amplified 55 polymorphic loci，the average polymorphic information content （PIC） was 0.41. The cluster analysis using UPGMA method showed that 88 watermelon germplasm resources were classified as 4 groups. The variance contribution of the first three principal coordinates were 22.8%，10.8% and 9.1%，cumulative proportion was 42.7%. In conclusion，the 88 watermelon germplasm resources contains relatively abundant genetic variations.

Key words： Citrullus lanatus； Germplasm resources； Genetic diversity； Phenotypic character； SSR molecular markers

西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai）是重要的經(jīng)濟作物，我國西瓜年種植面積近200萬hm2，面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1-2]。種質(zhì)資源是西瓜育種的基礎(chǔ)，是西瓜品種更新?lián)Q代的創(chuàng)新來源。對種質(zhì)資源進行挖掘利用，可以改良西瓜的品質(zhì)，提高產(chǎn)量，并增強西瓜抵御各種病蟲害的能力[3]。為了保護種質(zhì)資源，我國建有國家種質(zhì)長期庫和多種作物中期庫，其中蔬菜中期庫和西瓜甜瓜中期庫中分別保存有500余份和1 500余份西瓜種質(zhì)資源[4]。對西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析主要依據(jù)表型性狀和SSR分子標記技術(shù)。潘存祥等[5]采用變異系數(shù)、多樣性指數(shù)和聚類分析等方法，對國內(nèi)外783份西瓜種質(zhì)資源24個表型性狀進行了遺傳多樣性研究和聚類分析，結(jié)果表明，歐氏距離25可作為屬內(nèi)劃分西瓜種的遺傳距離，20可作為劃分西瓜亞種的遺傳距離，15可作為劃分西瓜變種的遺傳距離。范敏等[6]對從美國資源庫中引進的1 373份西瓜資源在新疆種植條件下，應用聚類分析和主成分分析方法將其分為5個類群、8大分枝。蘇玉環(huán)等[7]、陳萍等[8]也分別根據(jù)西瓜果實表型性狀，對100份和119份西瓜種質(zhì)資源進行聚類分析，分別將其聚類成4類和10類。分子標記技術(shù)以個體間的遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列堿基變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，直接反映了DNA水平的遺傳多態(tài)性，具有標記數(shù)量豐富、較高的遺傳穩(wěn)定性、多態(tài)性數(shù)量多、較強的化學穩(wěn)定性、技術(shù)簡單快速等[9]。劉麗娟等[10]利用21對SRAP引物標記對28個西瓜品種的遺傳多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)28份西瓜品種的多態(tài)性高達72.0%，各材料間相似系數(shù)在0.92至0.99之間，并將所有材料聚類劃分為4類。李朋飛等[11]運用SRAP分子標記技術(shù)對80份西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，這些西瓜種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)在0.94～1.00之間，通過聚類劃分為3個類群。以上對西瓜遺傳多樣性的研究分析發(fā)現(xiàn)，西瓜種質(zhì)材料遺傳背景較為狹窄，相似度較高，多數(shù)品種親緣關(guān)系較近，品種間同源性較高。本研究對88份來源不同的西瓜種質(zhì)資源進行表型性狀和SSR分子標記的遺傳多樣性分析，為西瓜種質(zhì)資源的研究利用和新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所保存的88份西瓜種質(zhì)資源，材料編號為E01-E88，名稱和來源見表1。

1.2 表型性狀調(diào)查

2013年將試驗材料種植在湖北省農(nóng)科院蔬菜基地中，按照《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[12]規(guī)定的描述規(guī)范、數(shù)據(jù)采集和記錄標準調(diào)查表型性狀，并對用文字描述部分的表型性狀進行賦值。用R軟件包對表型性狀進行描述性統(tǒng)計分析，計算最大值、最小值、平均數(shù)、標準差和變異系數(shù)。再對每個性狀進行標準化處理，以消除量綱的影響，而后用R軟件包進行主成分分析，用NTSYS軟件進行聚類分析并作圖。

1.3 SSR分析

在田間選取西瓜材料，對其幼嫩新鮮的葉片進行混合取樣，采用CTAB法[13]提取基因組DNA。用超微量分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo Fisher Scientific，USA）檢測DNA純度和濃度，然后將DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1備用。選用的23對引物是基于西瓜全基因組序列開發(fā)的能最大限度代表遺傳多樣性的SSR引物[14]。引物由武漢天一輝遠生物科技有限責任公司合成。

PCR反應體系（10 μL）：2×PCR mix（transgen for PAGE）4 μL；Primer F（10 μmol·L-1）0.5 μL；Primer R（10 μmol·L-1）0.5 μL；gDNA（20 ng·μL-1）1.5 μL；ddH2O 3.5 μL。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸15 s；34個循環(huán)；72 ℃延伸4 min；10 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳分離后，采用快速銀染法顯色并照相記錄[15]。

在電泳圖上相同的位置如果有帶記為“1”，無帶記為“0”，將SSR電泳結(jié)果轉(zhuǎn)化為數(shù)字矩陣。用NTSYS軟件進行聚類分析和主坐標分析。用Powermarker軟件計算等位基因數(shù)量、基因多樣性、雜合度和多態(tài)性信息含量等遺傳參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜表型性狀的描述性統(tǒng)計分析

對每個表型性狀進行了描述性統(tǒng)計分析，結(jié)果見表2。根據(jù)各性狀的變異系數(shù)進行分析可知：這些材料的坐果性狀、抗逆性、葉片缺刻對數(shù)、果實外觀、皮厚、糖分梯度均存在較為豐富的遺傳變異，而生育期性狀、分枝性、葉色、缺刻深淺、果實形狀、種子形狀遺傳范圍相對較窄。西瓜種質(zhì)資源的主要不利性狀如果實表面棱溝、兩性花率、腔內(nèi)發(fā)芽等遺傳變異均很大，在利用過程中要嚴格加以選擇。

2.2 西瓜表型性狀的主成分分析

對各個性狀的數(shù)據(jù)進行標準化后進行主成分分析。結(jié)果表明，第1、第2、第3主成分的方差貢獻率分別為：13.6%、11.8%和9.0%，前3個主成分的累計方差貢獻率為34.4%。由于同時對37個表型性狀進行分析，影響因素多，前14個主成分的方差貢獻率才達到80%。

根據(jù)每個表型性狀在前3個主成分中的荷載，前3個主成分主要反映的是果實、葉片和抗性性狀的差異，其中第1主成分主要反映的是果實大小、形狀和種子大小的差異，第2主成分主要反映的是果實坐果性狀和果實品質(zhì)的差異，第3主成分主要反映抗病性和葉片性狀的差異。

2.3 基于表型性狀的聚類分析

對表型數(shù)據(jù)進行標準化處理，計算品種間的歐氏距離，用UPGMA法進行聚類，結(jié)果見圖1。由圖1可知：E09和E58兩份材料之間的表型差異最小，而E06和E59與其他種質(zhì)之間的表型差異相對較大。聚類分析與主成分分析表現(xiàn)出了比較一致的結(jié)果。

在歐氏距離15.0時，可將材料分成2類，其中Ⅰ類包括E59這1份野生西瓜材料，其抗病性強、晚熟、難坐果、含糖量低，Ⅱ類包括其他87份材料；在歐氏距離13.5時，可將材料分為3類，其中Ⅰ類同上，Ⅱ-1類僅含E06這1份材料，花皮早熟小果型，種子千粒重6.6克，種子有腔內(nèi)發(fā)芽現(xiàn)象，Ⅱ-2類包括其他86份材料；在歐氏距離12.0時，可將材料分為4類，其中Ⅰ類和Ⅱ-1類同上，Ⅱ-2類又分為2組，其中Ⅱ-2-1組包括E43和E37這2份材料，其余材料為Ⅱ-2-2組。2.4 西瓜種質(zhì)材料遺傳差異的SSR分析

23對核心西瓜SSR標記中，除標記M17擴增失敗之外，其他22個標記都擴增出了高質(zhì)量的條帶，并在88份西瓜種質(zhì)材料之間表現(xiàn)出了多態(tài)性。其中M14的電泳結(jié)果見圖2。

用Powermarker軟件分析了SSR標記在88份西瓜種質(zhì)中檢測到的多態(tài)性參數(shù)，結(jié)果見表3。22個SSR標記中平均每個檢測到2.5個等位基因。M19檢測到的基因多樣性指數(shù)最高，為0.65，M2檢測到的最低，為0.18，平均為0.49。雜合度的分布范圍較廣，平均為0.52。M2檢測到的多態(tài)性信息含量最低，為0.17；M19檢測到的多態(tài)性信息含量最高為，0.58。22個SSR標記在88份材料中檢測到的平均多態(tài)性信息含量為0.41，表明供試的西瓜種質(zhì)材料之間蘊藏著中度的遺傳多樣性。

2.5 基于SSR標記的聚類分析

利用22對核心引物在88份材料中擴增出的55個多態(tài)性位點，計算種質(zhì)間Jaccard相似系數(shù)，利用UPGMA法進行聚類分析，聚類結(jié)果見圖3。由圖3可知：22對核心SSR標記并沒能檢測出E04、E10和E76之間，E09、E58、E69和E71之間，E46和E47之間，E48和E81之間，E78和E79之間的遺傳差異，表明這些種質(zhì)之間的遺傳相似度非常高。

在Jaccard相似系數(shù)0.50處，可將88份西瓜材料分為4個組，其中E06和E59都分別被單獨分為一組，其中E59為野生西瓜材料，晚熟、難坐果、含糖量低、抗病性強，而E06為早熟小果型材料，種子極小，千粒重僅6.6克。E07、E46和E21、E35等38份材料被分為一組，多數(shù)材料為花皮、早熟、果型較??；E01、E19和E41、E54等48份材料被分為一組，多數(shù)材料為黑皮、中晚熟、果型較大。

2.6 基于SSR標記的主坐標分析

利用22對核心SSR標記對88份西瓜種質(zhì)進行主坐標分析，其中第1、第2、第3主坐標的方差貢獻率分別為22.8%、10.8%和9.1%，前3個主坐標的累計方差貢獻率為42.7%。

3 討 論

本研究的表型性狀分析結(jié)果中，分枝性、果實縱橫徑比值、全生育期、葉片顏色、葉片缺刻深淺等變異系數(shù)小，具有較穩(wěn)定的遺傳特征；而兩性花率、種皮覆紋、果皮覆紋形狀、糖分梯度等變異系數(shù)大，存在較為豐富的遺傳變異。這與紀海波[16]、張法惺[17]的研究結(jié)果，在多數(shù)性狀上結(jié)論比較吻合，部分性狀則得出了不同的結(jié)論。原因一是可能和選用的種質(zhì)資源的來源不同有關(guān)，二是表型性狀標記受環(huán)境因素和人為因素的影響較大。

本研究前3個主成分的累計方差貢獻率僅為34.4%，前14個主成分累計才達到80%。與王志強等[18]的前3個主成分即達到84.31%差別較大，而與紀海波[19]的研究結(jié)果比較接近，這是由于采用的表型性狀數(shù)量不同所致，前者僅采用了6個表型性狀，而后者采用了22個。根據(jù)荷載分析，第1個主成分主要反映果實和種子的變異，第2主成分主要反映果實品質(zhì)和熟性的變異，第3主成分主要反映的是葉片性狀和抗逆性的差異，可見西瓜種質(zhì)資源的表型變異主要體現(xiàn)在果實形狀、品質(zhì)和葉片等性狀上。

基于表型性狀和SSR分子標記的聚類分析，均能較好的將88份西瓜種質(zhì)資源進行區(qū)分，與陳萍[8]、紀海波[19]、潘存祥[5]等的研究得出了相似的結(jié)論，兩種方法都能將野生西瓜資源E59和種子極小、有腔內(nèi)發(fā)芽現(xiàn)象的小果型西瓜資源E06單獨聚為1組。但在其他分組結(jié)果上存在一定的差異，與張法惺[20]的研究結(jié)果比較一致。

4 結(jié) 論

對88份不同來源的西瓜種質(zhì)資源選擇37個表型性狀和22對西瓜核心SSR標記進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明這些材料中存在較為豐富的遺傳多樣性。形態(tài)學標記較為直觀、具體，但在操作時易受環(huán)境因素和人為因素影響。SSR分子標記是從分子水平揭示西瓜種質(zhì)資源之間的差異，通過選擇合適的標記，能夠很好的揭示西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性。這兩種方法從不同的水平和角度出發(fā)，表達不同的遺傳信息，可互相補充。

參考文獻

[1] 馬躍. 透過國際分析，看中國西瓜甜瓜的現(xiàn)狀與未來[J]. 中國瓜菜，2011，24（2）： 64-67.

[2] 戴照義，王運強，郭鳳領(lǐng)，等. 西瓜安全生產(chǎn)技術(shù)指南[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012，1-16.

[3] 馬雙武，王吉明，韋小敏. 我國西瓜特異種質(zhì)資源研究利用進展[J]. 植物遺傳資源學報，2006，7（4）： 484-487.

[4] 馬雙武，王吉明，邱江濤，等. 我國西瓜甜瓜種質(zhì)資源收集保存現(xiàn)狀及建議[J]. 中國西瓜甜瓜，2003（5）： 17-19.

[5] 潘存祥，許勇，紀海波，等. 西瓜種質(zhì)資源表型多樣性分析及聚類分析[J]. 植物遺傳資源學報，2015，16（1）： 59-63.

[6] 范敏，宮國義，張瑞麟，等. 美國資源庫西瓜種質(zhì)的初步觀察與數(shù)量分類[J].中國西瓜甜瓜，2004（4）： 1-3.

[7] 蘇玉環(huán)，王靜華，李文芹，等. 西瓜種質(zhì)資源果實性狀及聚類分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報，2008，31（6）： 21-25.

[8] 陳萍，祝佳強，祝雙田，等. 西瓜種質(zhì)材料果實性狀的變異性和聚類分析[J].北方園藝，2010（17）： 182-184.

[9] 焦仁海，孫發(fā)明，劉興二，等. 玉米DNA分子標記及其研究進展[J]. 中國農(nóng)學通報，2006，22（4）： 48-51.

[10] 劉麗娟，舒烈波，羅利軍，等. SRAP標記與形態(tài)學標記在西瓜DUS測試中的比較[J]. 植物遺傳資源學報，2011（5）： 790-795.

[11] 李朋飛，霍秀愛，程永強，等. 基于SRAP的西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性評價[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報，2013（2）： 89-96.

[12] 馬雙武，劉君璞，王吉明，等. 西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005： 9-53.

[13] Murry H G，ThomsPon W F. Rapid isolation of weight DNA[J]. Nucleie Acid Res，1980，8（19）： 4321.

[14] Zhang H Y，Wang H，Guo S G，et al. Identification and validation of a core set of microsatellite markers for genetic diversity analysis in watermelon，Citrullus lanatus（Thunb.） Matsum. & Nakai[J]. Euphytica，2012，186（2）： 329-342.

[15] Bassam B J，Caetano-Anolles G，Gresshoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in poly-acrytamide gels[J]. Analytical Bio chemistry，1991， 196（1）： 80-83.

[16] 紀海波，張玉鑫，李玉明，等. 西瓜種質(zhì)資源主要性狀的表型多樣性[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2013，41（8）：34-38.

[17] 張法惺，欒非時，盛云燕. 不同生態(tài)類型西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 中國蔬菜，2010（14）： 36-43.

[18] 王志強，郭松，劉聲鋒，等. 西瓜種質(zhì)資源果實主要數(shù)量性狀的主成分分析[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，2014，45（3）： 59-64.

[19] 紀海波. 西瓜種質(zhì)資源表型多樣性研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2013.

[20] 張法惺. 西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2010.