曲玲玲，郭慶啟，石彥國，張 娜**

（1.哈爾濱商業(yè)大學/黑龍江省普通高校食品科學與工程實驗室，哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱 150040）

大豆蛋白是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源之一，其營養(yǎng)價值高，且大豆蛋白的消化吸收率在84%～98%之間，可以直接作為人體蛋白質(zhì)的主要來源，更為重要的是大豆蛋白還具有與食品的嗜好性、加工性等相關的各種功能特性[1-2]。其良好的能性質(zhì)在改進食品結(jié)構(gòu)、發(fā)展新食品方面有著重要意義。廣泛應用于嬰幼兒食品、烘焙食品、肉制品、乳制品等行業(yè)之中，其重要性日趨明顯[3]。大豆蛋白因為它的蛋白含量高，又可以改變食品的組織結(jié)構(gòu)和功能性，增加食品的營養(yǎng)成分及物理性能，所以在許多食品中可替代昂貴的分離蛋白和乳蛋白。

大豆蛋白對食品的質(zhì)構(gòu)、風味和加工性狀產(chǎn)生重大影響，這主要是因為蛋白具有不同的功能性質(zhì)。了解大豆蛋白的功能特性，有助于在食品加工業(yè)中正確使用大豆蛋白資源，也利于食品營養(yǎng)成分的保持和利用，本文系統(tǒng)地介紹了大豆蛋白的結(jié)構(gòu)對功能性質(zhì)影響與結(jié)構(gòu)表征的方法，滿足人類對大豆蛋白營養(yǎng)價值的需求。

1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對功能特性的影響

大豆蛋白質(zhì)的功能特性主要指溶解性、乳化活性、吸油性、粘度和凝膠性，這些功能特性對食品加工十分重要。大豆蛋白具有復雜的初級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，大豆蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定大豆蛋白的功能特性。因此，凡是能夠改變蛋白結(jié)構(gòu)的因素，必將影響其功能特性[4]。

近年來，國內(nèi)外有許多學者通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來提高物質(zhì)本身的功能性質(zhì)。布冠好等[5]人對大豆蛋白－乳糖復合物的結(jié)構(gòu)和功能特性進行了研究。通過三硝基苯磺酸（TNBS）法、SDSPAGE電泳、紫外光掃描等方法研究蛋白結(jié)構(gòu)的變化。對不同時間下糖基化產(chǎn)物的功能特性結(jié)果表明，大豆蛋白的溶解性在36 h時改善效果最好，與純大豆分離蛋白相比，溶解性增加了大約30%；糖基化復合物的乳化性提高，乳化活性及乳化穩(wěn)定性分別在24、36 h達到最大。華欲飛[6]等研究了FSPC的乳化性能，結(jié)果表明：FSPC的乳化活性及乳化穩(wěn)定性與大豆分離蛋白相似，對固體脂肪的乳化能力超過分離蛋白，添加在乳化型碎肉制品中可使產(chǎn)品得率及質(zhì)構(gòu)超過添加分離蛋白的肉制品。Jeng-YuneLi[7]等對大豆?jié)饪s蛋白和玉米淀粉的合成物進行了熱分析、流變分析和凝膠特性的分析。在二者形成的合成物中，大豆?jié)饪s蛋白減少了玉米淀粉的水分活度并增加了其吸熱溫度。張梅[8]等研究了功能性大豆?jié)饪s蛋白性能及其應用，證實功能性大豆?jié)饪s蛋白的NSI值明顯提高，大豆蛋白功能特性有不同程度提高和改。研究還表明：經(jīng)物理方法改性的FSPC，有較好凝膠性、乳化性、持油和持水性。而經(jīng)酶法改性的FSPC有較好溶解性和乳化性。

2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征方法

吸附于表面的蛋白質(zhì)存在各種不同取向，采用各種先進儀器對與蛋白質(zhì)相互作用的表面進行表征可大大幫助人們更為深入地了解蛋白質(zhì)和表面之間的相互作用，以及獲得界面蛋白質(zhì)有序度方面的信息[9]。

2.1 熱分析法

熱分析技術是研究物質(zhì)的物理化學性質(zhì)時依據(jù)溫度變化而進行測量的一種動態(tài)分析技術。熱分析技術的種類很多，有熱重法（TG），差熱分析法（DTA），差示掃描量熱法（DSC）等[10]。廣泛應用于大豆蛋白研究的方法是差示掃描量熱法（DSC）。

近年來，DSC在大豆蛋白功能性質(zhì)研究中主要要涉及大豆蛋白11S和7S成分熱屬性及pH、離子強度、鈣離子、乙醇、2-巰基乙醇對大豆蛋白理化及功能性質(zhì)的影響，也涉及有關大豆蛋白水結(jié)合性能及其分散相流變性質(zhì)研究，Peturecclli等[11]人通過DSC法研究大豆分離蛋白熱穩(wěn)定性中pH誘導改性。實驗表明未經(jīng)熱處理的大豆分離蛋白，pH增加導致疏水性增加。將pH 10～11和溫度約65℃時的熱處理相結(jié)合導致疏水基團更多暴露，該條件下是最適合獲得具有較高乳化能力的大豆分離蛋白。Lakemond等[12]人對研究大豆球蛋白的比率影響熱變性的影響因素研究中。通過用DSC和CD（圓二色性）的結(jié)合研究表明，在pH 7.6時，大豆球蛋白主要以11S形式存在，在熱變性過程中，連接酸性和堿性亞基的二硫鍵斷裂。DSC研究發(fā)現(xiàn)酸性亞基進一步裸露可能與較高的吸熱轉(zhuǎn)變溫度和放熱轉(zhuǎn)變的出現(xiàn)有關。大豆球蛋白的變性/聚集（DSC研究）和二級結(jié)構(gòu)的改變（遠紫外-CD研究）是同時發(fā)生的。

綜上，大豆蛋白的DSC法在研究食品蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和變性動力學方面具有其不可替代的優(yōu)勢，在食品生產(chǎn)過程中調(diào)節(jié)大豆蛋白的功能屬性以利于其合理利用是非常重要的。此外，運用熱分析法對于食品蛋白質(zhì)新資源的開發(fā)具有重要的意義，相信這些研究成果將有助于拓寬大豆蛋白在食品生產(chǎn)中的應用。

2.2 力學性能表征

質(zhì)構(gòu)和流變性是大豆蛋白力學性能表征的重要方法。質(zhì)構(gòu)是蛋白的一種有關脆、酥、硬、滑、粘等機械性感觀性質(zhì)，可從表觀上表征大豆蛋白的狀態(tài)，也可以從中了解蛋白質(zhì)及其組分的作用力。

Elena等[13]用質(zhì)構(gòu)分析儀（TPA）測定了大豆蛋白的質(zhì)構(gòu)特性，結(jié)果表明，對于11S蛋白，經(jīng)高溫再高壓處理的凝膠硬度比先高壓再高溫處理的凝膠硬度更高，蛋白質(zhì)分子中的化學鍵在預處理過程中被破壞，再形成的化學鍵對凝膠硬度有不同的影響。Puppo等[14]研究了大豆蛋白分散液和大豆蛋白乳化液的流變學行為，考察了熱致大豆蛋白凝膠的流變學參數(shù)，結(jié)果顯示大豆蛋白凝膠比其他醬類具有更高的彈性模量和粘稠度，且大豆蛋白這種結(jié)構(gòu)是由分子間的疏水作用所穩(wěn)定。

2.3 電泳法

十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是大豆蛋白分析中比較常用的方法，可測定蛋白質(zhì)亞基分子量，研究不同分子量組分的情況。Yi JB[15]等人在研究由微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）共價交聯(lián)大豆分離蛋白，對交聯(lián)產(chǎn)物進行體外胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化，通過SDSPAGE電泳進行分析（見圖1，泳道1）。

圖1 在37℃的不同時間下，大豆分離蛋白（SPI）的SDS-PAGE凝膠電泳圖

由圖1可以看出，SPI主要被分成大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白兩部分。當培養(yǎng)與MTGase催化（20 U/g），在37℃，增加反應時間從0～360min，大部分大豆蛋白質(zhì)成分的β-球蛋白和酸性亞基（AS）持續(xù)下降，并且相應地，新的高分子生物聚合物逐漸增加，而大豆球蛋白的基本亞基（BS）的在整個期間幾乎沒有影響（見圖1，泳道2～8）。

Tang等[16]通過電泳還發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白組分比β-伴大豆球蛋白組分更容易形成高分子量的生物聚合物，而且球蛋白的酸性亞基比β-伴大豆球蛋白的各組分更容易被MTGase聚合或交聯(lián)。SDSPAGE的定量研究中多采用光度掃描或凝膠成像系統(tǒng)進行。

2.4 波譜法

通過各種波譜觀察大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化，以深入地了解大豆蛋白結(jié)構(gòu)的變化，如紅外光譜、核磁共振和圓二色光譜等[17]。

2.4.1 傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR） ATRFTIR是一種分析蛋白質(zhì)表面吸附取向與構(gòu)象的技術。ATR的應用極大地簡化了一些特殊樣品的測試，使微區(qū)成分的分析變得方便而快捷，檢測靈敏度可達10-9數(shù)量級，測量顯微區(qū)直徑達數(shù)微米[18]。

從紅外譜圖上酰胺鍵特征吸收峰的變化，可推蛋白分子的改性程度和交聯(lián)情況。黃友如等[19]人應用FTIR研究了不同亞油酸濃度下脂肪氧合酶催化誘導產(chǎn)生的大豆蛋白聚集體的構(gòu)象變化。結(jié)果表明，在紅外光譜圖中，具有兩個較為明顯的特征，一是1 610 cm-1或1 615 cm-1附近譜峰分量的出現(xiàn)，二是酰胺I′各譜峰分量向低波數(shù)方向位移。當大豆蛋白與脂肪氧合酶催化的亞油酸反應時，通過氫鍵形成的分子間β-折疊結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和聚集體形成中發(fā)揮著重要的作用，并揭示了聚集蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化與大豆蛋白的聚集程度密切相關。

2.4.2 拉曼光譜（SERS） 拉曼光譜是一種能夠提供蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)信息的非破壞性的直接分析技術，相對傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜和圓二色譜，拉曼光譜可以提供蛋白質(zhì)更為廣泛的結(jié)構(gòu)信息[20]。最早在1972年，Strekas和Spiro的工作揭開了拉曼光譜研究血紅蛋白結(jié)構(gòu)的新篇章。

近年來，有關利用拉曼光譜分析大豆蛋白構(gòu)型的研究國內(nèi)外均有報道[18]。李迎秋[21]等人通過運用激光拉曼光譜研究了脈沖電場對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是β-折疊和無規(guī)則卷曲。通過酰胺I帶和酰胺III帶拉曼特征峰的變化，說明脈沖處理使蛋白的β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加，脈沖電場對巰基和二硫鍵有一定的影響。酪氨酸特征振動頻率的變化說明脈沖電場破壞了維持蛋白三級結(jié)構(gòu)的氫鍵，使埋藏在疏水環(huán)境中的酪氨酸殘基暴露到分子的表面，更強的脈沖條件使暴露到蛋白表面的酪氨酸疏水基團進一步相互作用，形成疏水性強的基團埋藏在分子內(nèi)部，從而導致蛋白功能性質(zhì)的改變。Wong[22]等人分析了酰胺化大豆分離蛋白和脫酰胺化的大豆分離蛋白的Ra?man光譜，研究其蛋白質(zhì)分子微觀結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)表示C-O伸縮振動的1 780 cm-1波段強度與1 003 cm-1波段強度的比值隨著大豆分離蛋白脫酰胺作用程度的增加而增大。ZHAO[23]利用拉曼光譜分析添加乙?；拇蠖狗蛛x蛋白的酯化作用效果和結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)1 737 cm-1附近峰相對吸收強度與O-酯化作用程度成正比關系。

2.4.3 圓二色光譜（CD） 由于光學活性分子對左、右圓偏振光的吸收不同，使得左、右圓偏振光透過后變成橢圓偏振光，這種現(xiàn)象就是圓二色性（circular dichroism，CD）[24]。圓二色光譜既可用于大生物分子聚合物的空間構(gòu)型、構(gòu)象的靜態(tài)研究，也可用于當環(huán)境發(fā)生變化時，這些聚合物空間構(gòu)象的動態(tài)變化過程。但是，CD技術不能直接提供蛋白質(zhì)分子和表面結(jié)合點的具體信息。Zhao J等[25]人對大豆蛋白水解物的結(jié)構(gòu)特點進行研究中，運用CD技術計算出的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量的變化，但結(jié)果與ATRFTIR的結(jié)果一致。

2.4.4 核磁共振 核磁共振（簡稱NMR）是基于原子核磁性的一種波譜技術，是一種鑒定有機化合物結(jié)構(gòu)和研究化學動力學等的現(xiàn)代儀器分析方法[26]。NMR技術是能夠在原子分辨率下測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的唯一方法[27]。

利用核磁共振法能夠測定溶液中大豆蛋白改性中構(gòu)象的變化，還可研究蛋白分子的構(gòu)象動力學。Kakalis等[28]人運用13C-NMR光譜研究提供有關7S大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)和大豆蛋白加工如蛋白膠凝、蛋白改性和組織化新的而詳細的信息。田少君[29]等人對大豆分離蛋白的磷酸化改性進行研究，通過核磁共振分析發(fā)現(xiàn)磷酸化反應主要發(fā)生在大豆蛋白的賴氨酸和絲氨酸等含-NH2或-OH的殘基上。

2.4.5 X射線光電子能譜 X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）技術也被稱作用于化學分析的電子能譜（electron spectroscopy for chemicalanalysis，ESCA）。XPS不僅能夠給出材料表面的化學組成及含量，而且可以分析出化學價態(tài)、化學鍵等信息[30]。角分辨XPS可以在極薄的表層內(nèi)對化學信息進行表征[31]，利用成像XPS技術，可以提供分析區(qū)域內(nèi)的元素及其化學狀態(tài)分布的信息圖像，并可由圖得譜。自德國物理學家倫琴1895年發(fā)現(xiàn)X射線以來，與其有關的分析技術不斷問世，X射線光電子能譜分析法就是其中的一種。

2.5 微觀結(jié)構(gòu)分析法

運用電子掃描顯微鏡、原子力顯微鏡等可直接觀察蛋白質(zhì)的微觀表面形貌。

2.5.1 原子力顯微鏡（AFM） AFM（atomic force microscopy，AFM）能提供可靠的生物介質(zhì)表面單分子水平尺度形貌信息，并以其高分辨率，操作簡單，制樣容易等特點而備受關注，若對小范圍的樣品表面的圖像進行分析，還可以獲得物質(zhì)的晶形結(jié)構(gòu)、分子的結(jié)構(gòu)、聚集狀態(tài)、表面積及體積等方面的信息。

圖2 β-球蛋白及其亞基熱誘導聚集的AFM圖像

AFM允許動態(tài)地研究蛋白質(zhì)在生命活動不同時刻的狀態(tài)，在蛋白質(zhì)組裝動力學研究中具有優(yōu)勢。AFM與蛋白質(zhì)單分子水平上研究蛋白質(zhì)識別也得到一定的發(fā)展。AFM將蛋白質(zhì)研究帶到了一個新的微觀層面，它已在蛋白質(zhì)成像、吸附、組裝、蛋白質(zhì)之間相互作用、蛋白質(zhì)與其他生物分子之間相互作用以及其他一些與蛋白質(zhì)有關的研究中得到了廣泛關注[32]。王昌盛[33]運用AFM所觀察到的不同離子強度下的7S球蛋白80℃加熱不同時間后的原子力圖。結(jié)果表明，隨著7S球蛋白濃度的增大，使得“組裝單元”充足，使得7S球蛋白更容易發(fā)生自組裝纖維化反應。

Yuan等[34]人運用AFM研究大豆β球蛋白亞基的改進提取方法見圖2所示。

如圖2所示，不同樣品形成的聚集體顯示出不同的形態(tài)模式。在樣品制備過程中，不溶性沉淀物通過離心去除，同時對聚集體進行觀察，得到幾種不同的形態(tài)模式。圖a中β-伴大豆球蛋白的情況下更有序，并形成滯留聚集亞基。圖b中情況是相似的，β-伴大豆球蛋白較前者的聚集體情況更無序，成蠕蟲狀。圖c形成的聚集體的形態(tài)呈芽狀，雖然由于質(zhì)量不均勻使其制備過程中樣品分散，但還可以看得到。而在圖d的情況下，亞基沒有觀察到有序的聚集。

2.5.2 掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）可以觀察蛋白質(zhì)微小顆粒的表面形貌，還可以與能譜儀配合進行顆粒粒徑及數(shù)量的測量與統(tǒng)計，測試準確度高，因而在大豆蛋白的分析領域具有不可替代的作用[35-36]。

段春紅等[37]人對大豆7S球蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的進行結(jié)構(gòu)表征，通過對粉體的SEM進行觀察和分析。圖3為7S球蛋白及不同水解度的7S球蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

從圖3可以看出，同未水解7S球蛋白相比較，酶解后樣品在相同的觀察條件下，其粉體結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。未水解的7S球蛋白表面部分有輕微坑洼現(xiàn)象，隨著水解程度的增加，7S球蛋白酶解產(chǎn)物的表面結(jié)構(gòu)更為疏松。實驗結(jié)果說明酶解改變了7S球蛋白的表面結(jié)構(gòu)。

2.5.3 掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunneling Microscopy，STM）與其他種類的顯微鏡相比，它的分辨本領卻可以達到10-10m。以量子力學為基礎的掃描隧道顯微鏡，可以在大氣、液體、真空狀態(tài)下工作，可以在4.2～1 000 K之間的溫度下工作；并且對樣品也無特殊要求，可以測量單晶、多晶、非晶等樣品表面；特別是掃描隧道顯微鏡可以與其他實驗設備結(jié)合，應用更加有效、靈活。因此，掃描隧道顯微鏡在物理學、化學、生物學、納米材料等領域中都得到了深入而廣泛的應用，并取得了一系列重要的研究成果[38]。

圖3 不同水解度7S球蛋白掃描電鏡圖譜

3 小結(jié)和展望

大豆蛋白制品的功能特性及用途直接與產(chǎn)品加工工藝有關，不同工藝加工的產(chǎn)品有不同的功能特性。所以要致力于開發(fā)多品種、多功能、系列化的大豆蛋白產(chǎn)品，以充分體現(xiàn)功能性大豆蛋白的高營養(yǎng)、高附加值。要加大基礎研究的力度，研究大豆蛋白提高各種功能特性的機理。剖析各種理化及生物因素對蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化的影響，只有真正掌握這些變化規(guī)律，才能開發(fā)出更多更好的大豆蛋白產(chǎn)品，以應用于更廣闊的市場領域。

近年來，對食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)的研究很多[39]，但是對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)聯(lián)系的了解比較少，人們對蛋白質(zhì)表征方面的研究已經(jīng)取得了一定進展。由于計算機性能的快速發(fā)展，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究進展迅速。理論計算不僅提供了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)的信息如：能級、表面電荷分布、分子軌道相互作用等，而且還提供了蛋白質(zhì)與周圍環(huán)境（如水、離子和某些小分子）的相互作用。但是也還存在很多問題，還需要科學工作者更細致深入的分析和研究。

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