包姍姍，楊九艷＊，趙玲玲，張璞進，牛云雷，應海剛

（1 內蒙古大學 生命科學學院，呼和浩特010021；2 中國科學院內蒙古草業(yè)研究中心，呼和浩特010030；3 赤峰市巴林左旗農牧業(yè)局，內蒙古赤峰025450）

小葉錦雞兒（CaraganamicrophyllaLam.）與中間錦雞兒（CaraganaintermediaKuang et H.C.Fu）是豆科錦雞兒屬（CaraganaFabr.）多年生灌木，主要分布在中國北方溫帶干旱－半干旱地區(qū)，其中小葉錦雞兒為典型草原及荒漠草原旱生灌木，中間錦雞兒為典型草原及荒漠草原沙生旱生灌木［1］，在植樹造林［2］、防風固沙［3］、飼用及藥用［4－6］等方面均具有重要價值，對生態(tài)環(huán)境建設及社會經濟發(fā)展起到特殊作用。

小葉錦雞兒與中間錦雞兒是錦雞兒屬較為常見的2個物種，二者的分類學關系至今仍存在許多爭議。許多學者將其歸為2個種，認為中間錦雞兒是小葉錦雞兒與檸條錦雞兒的中間類型或雜交種［7］；也有些學者將其歸為一個種［8－9］，認為中間錦雞兒為小葉錦雞兒的親本之一［10］。分子生物學及分析技術的發(fā)展為研究物種間的生物學關系提供了更為有效的方法。ISSR 分子標記［11］由于其操作簡單、重復性好、多態(tài)性高且費用低廉，當前，ISSR 技術應用的領域已從植物擴展到真菌。本試驗利用ISSR 分子標記技術，對小葉錦雞兒、中間錦雞兒共15個種群進行了遺傳多樣性分析，旨在從較大跨度范圍內，研究內蒙古高原小葉錦雞兒與中間錦雞兒的遺傳關系，并闡明其呈替代性分布的遺傳基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

于2013年8～9月在內蒙古由東向西，按照水分逐漸減少的梯度選取15個樣點采集小葉錦雞兒、中間錦雞兒的葉片，這15個樣點分別位于典型草原以及荒漠草原上，其中小葉錦雞兒7個種群，中間錦雞兒8個種群。每種隨機選取24株，各株距不低于10m，采集葉片，并用變色硅膠進行快速干燥，保存?zhèn)溆?。采樣地點見表1、圖1。

15個采樣地點各隨機選取3 個重復對土壤樣品進行采集，每個重復包含3 層土壤樣品：0～10 cm、10～20cm、20～30cm，所采集土壤樣品用于土壤養(yǎng)分的測定。

表1 15個種群采樣地點Table1 Sampling positions of 15populations

1.2 ISSR 擴 增

采用試劑盒（Tiangen 公司生產的Plant Genomic DNA Kit植物基因組DNA 提取試劑盒），從硅膠干燥固定的葉片中提取DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

本研究所用PCR 引物購自南京博爾迪生物科技有限公司，經過篩選最終確定對全部DNA 樣品均有清晰、穩(wěn)定多態(tài)性擴增條帶且重復性好的引物12條（表2），所選用Marker分子量范圍為100～3 000bp。

ISSR 擴增反應經過比較和優(yōu)化確定為20μL反應體系：模板1μL，引物1μL，2×TaqMix 10 μL、ddH2O 8μL補至20μL。

PCR 擴增條件為：94 ℃預變性5min；94 ℃變性45s，51～53℃復性45s，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 產物于2%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）中電泳檢測，電流220mA、電壓100V、電極緩沖液為1×TAE、電泳時間為50 min。電泳結束后在Syn－Gene凝膠成像系統(tǒng)下觀察照相。

圖1 各采集樣點分布圖Fig.1 Sampling site distribution map

表2 ISSR 引物及其序列和多態(tài)性分析Table2 ISSR primers and the sequence polymorphism analysis

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以清晰可辨的擴增條帶在相對遷移位置的有無記數(shù)，每個可辨帶代表一個變異，在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0，生成分子數(shù)據(jù)矩陣。利用Popgene 3.2統(tǒng)計ISSR 擴增產物的多態(tài)位點百分數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）、遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）。應用Structure 2.3.2軟件對15 個錦雞兒種群的遺傳結構進行鄰接聚類分析。

1.4 相關性分析

本研究利用SPSS 17.0對小葉錦雞兒、中間錦雞兒遺傳多樣性各指數(shù)與氣象因子、土壤因子做逐步回歸，進行相關性分析。其中氣象因子選取5個：年降水量、年平均氣溫、年平均相對濕度、年日照時數(shù)和有效積溫，該氣象數(shù)據(jù)均取自中國氣象科學數(shù)據(jù)共享服務網自1960年至2012年的數(shù)據(jù)；土壤因子共測定了以下5 項：全氮、全磷、全碳、有機碳和pH 值。并用Mantel檢驗［12］進行相關性檢測。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

用12條引物對小葉錦雞兒、中間錦雞兒的共360個個體的DNA 樣品進行擴增，其中小葉錦雞兒個體168個，中間錦雞兒個體192個，部分擴增結果見圖2。

2.1.1 小葉錦雞兒居群 小葉錦雞兒7個種群共168個個體，經PCR 擴增后共得到331 個條帶，其中多態(tài)位點數(shù)為325個，小葉錦雞兒物種水平上的多態(tài)位點百分數(shù)為98.19%（表3），從中可以看出小葉錦雞兒的遺傳多樣性很高［13］。從表3可以看出，不同種群多態(tài)位點百分數(shù)是不同的，多態(tài)位點百分數(shù)從小到大依次為種群Ca1＜Ca5＜Ca7＜Ca12＜Ca4＜Ca3＜Ca2。

Nei’s基因多樣性指數(shù)是衡量居群多樣性的最常用指標。本研究顯示，其變化范圍在0.233 4～0.282 7之間，從小到大為種群Ca1＜Ca12＜Ca7＜Ca5＜Ca3＜Ca4＜Ca2。

Shannon信息指數(shù)分析結果與Nei’s基因多樣性指數(shù)所顯示結果趨于一致，其變化范圍為0.354 5～0.426 5，從小到大依次為種群Ca1＜Ca12＜Ca7＜Ca5＜Ca3＜Ca4＜Ca2。

從總體上看，小葉錦雞兒種群總的Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.289 7，Shannon 信息指數(shù)為0.444 0，由此也可以看出小葉錦雞兒種內具有豐富的遺傳多樣性。

2.1.2 中間錦雞兒居群 經PCR 擴增后，中間錦雞兒8個種群192個個體共擴增出330個條帶，其中多態(tài)性位點數(shù)為329個，多態(tài)位點百分數(shù)為99.7%（表4），從多態(tài)位點百分數(shù)可以粗略地看出中間錦雞兒的遺傳多樣性非常高。各種群的多態(tài)位點百分數(shù)由低到高依次為Ca10＜Ca14＜Ca13＜Ca9＜Ca15＜Ca8＜Ca6（表4）。Nei’s基因多樣性指數(shù)與Shannon信息指數(shù)所表達的結果相同，從小到大都為Ca10＜Ca14＜Ca9＜Ca13＜Ca15＜Ca8＜Ca6（表4）。

圖2 引物AW77939 對小葉錦雞兒種群Ca2和中間錦雞兒種群Ca14的擴增圖譜Fig.2 Primer AW77939amplification patterns of C.microphylla population Ca2and C.intermedia population Ca14

表3 小葉錦雞兒種群ISSR 檢測遺傳多樣性結果Table3 The results of C.microphyllaISSR genetic diversity

表4 中間錦雞兒種群ISSR 檢測遺傳多樣性結果Table4 The results of C.intermediaISSR genetic diversity

總體看來，中間錦雞兒種群總的Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.312 8，Shannon信息指數(shù)為0.478 4，由此可知，中間錦雞兒種內具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 遺傳結構與基因流分析

2.2.1 小葉錦雞兒居群 從表5看出，小葉錦雞兒居群的總基因多樣度為0.289 7，其中居群內基因多樣度為0.255 2，居群間遺傳分化系數(shù)為0.119 0。

居群間遺傳分化系數(shù)是反映群體遺傳分化程度的重要指標［14］。7個小葉錦雞兒種群的分化系數(shù)在0.05～0.15之間，表明小葉錦雞兒種群具有中等程度的遺傳分化。本研究中7個小葉錦雞兒居群間的基因流為3.701 0，表明居群間基因流頻繁，而居群間遺傳分化并非由遺傳漂變所致。

2.2.2 中間錦雞兒居群 由表6可以看出，總基因多樣度為0.312 8，其中居群內基因多樣度為0.253 9，居群間遺傳分化系數(shù)為0.188 1，表明中間錦雞兒種群存在較大程度的遺傳分化。中間錦雞兒居群間的基因流為2.157 8，表明中間錦雞兒居群間的遺傳分化也并非由遺傳漂變所致。

表5 小葉錦雞兒種群的遺傳分化Table5 Genetic differentiation of C.microphylla population

2.3 遺傳距離與遺傳一致度分析

2.3.1 小葉錦雞兒居群 基因分化系數(shù)雖然能夠對居群分化的程度作出評價，但卻不能判定居群間相互關系的遠近，而居群間的遺傳距離用來表明每兩個居群間彼此關系的遠近，進一步說明居群間遺傳分化程度的高低。從表7可以看出，小葉錦雞兒種群Ca5與Ca7間的遺傳距離最近，為0.025 5，而種群Ca1 與Ca7 間的遺傳距離最遠，為0.067 1。各居群遺傳一致度在0.935 1～0.974 8之間。各居群間的平均遺傳距離為0.048 1，平均遺傳一致度為0.953 1，說明居群間遺傳距離較低，而居群間的相似程度較高。

2.3.2 中間錦雞兒居群 表8顯示的是中間錦雞兒居群間的遺傳距離與遺傳一致度。從表8可以看出，中間錦雞兒居群間的遺傳距離變化范圍在0.029 0～0.286 8之間，遺傳一致度的變化范圍在0.750 6～0.971 4之間，其中種群Ca9與Ca10的遺傳距離最小，為0.029 0，而遺傳一致度最大，為0.971 4，表明種群Ca9和Ca10的遺傳相似性最大；種群Ca6與Ca14之間的遺傳距離最大，為0.286 8，而遺傳一致度最小，為0.750 6，表明種群Ca6 與Ca14的遺傳相似性最小。各居群間平均遺傳距離為0.100 0，平均遺傳一致度為0.909 4。

表6 中間錦雞兒種群的遺傳分化Table6 Genetic differentiation of C.intermedia population

2.4 聚類分析

從圖3可知，種群Ca4 和Ca5 聚為一個群體（紅色），其余種群各自成獨立的群體；種群Ca3有2種主要的遺傳成分；每個種群都有其他種群的遺傳成分滲入，15個種群間都有共同的遺傳成分。

鄰接聚類分析結果如圖4所示，種群Ca1、Ca2、與Ca3聚為一支，再與聚為一支的種群Ca4和Ca5相聚，之后與種群Ca7 以及聚為一支的種群Ca8、Ca9、Ca10聚合，再與種群Ca6以及聚為一支的種群Ca11、Ca12聚合，最后依次與種群Ca13、Ca14和Ca 15依次相聚。由此結果可以看出，同種錦雞兒各種群的親緣關系最近；中間錦雞兒和小葉錦雞兒的各種群在聚類時發(fā)生了交叉，揭示了中間錦雞兒和小葉錦雞兒遺傳關系密切。從總體上看，15個錦雞兒種群表現(xiàn)為從東到西逐漸聚類。

表7 小葉錦雞兒種群遺傳距離與遺傳一致度Table7 Nei’s genetic distance and genetic identity of C.microphylla

表8 中間錦雞兒種群遺傳距離與遺傳一致度Table8 Nei’s genetic distance and genetic identity of C.intermedia

2.5 遺傳距離與地理距離的相關性

Mantel檢驗是由Nathan Mantel所提出［12］，是對兩個矩陣相關關系的檢驗，在種群遺傳學、群落生態(tài)學等領域都已得到廣泛應用。本研究對小葉錦雞兒與中間錦雞兒兩兩種群間的遺傳距離與地理距離的相關性進行Mantel檢驗。分析得出，相關系數(shù)r＝0.695 1（P＞0.05），表明錦雞兒種群的遺傳分化與地理距離有一定的相關性，但相關性并不顯著，說明錦雞兒種群的遺傳變異并非由地理距離所產生的遺傳漂變所致。

2.6 ISSR 遺傳多樣性各指數(shù)與氣象因子及土壤因子之間的相關性分析

圖3 15個錦雞兒種群的遺傳結構結果（運用Structure中的混合模型）Fig.3 Results of Bayesian analysis of 15populations of Caragana using admixture model in Structure

以15個錦雞兒種群的ISSR 遺傳多樣性各指數(shù)（有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)位點數(shù)、多態(tài)位點百分數(shù)）為因變量，以包括經緯度、海拔高度，氣象因子、土壤因子在內的共23個因子做自變量，在SPSS 17.0中分別作逐步回歸。引入變量P值確定為0.05，剔除變量P值為0.10。如表9所示，各遺傳多樣性指數(shù)僅與平均氣溫這一氣象因子有相關關系，剔除22個其他變量。在以有效等位基因數(shù)為因變量的逐步回歸中，引入平均氣溫這一自變量，且該因子對有效等位基因數(shù)的解釋程度為44.4%，同時引入的截距項也與有效等位基因數(shù)存在顯著相關關系，方差分析顯示模型達顯著水平（P＝0.018＜0.05），說明模型的解釋效果較好。平均氣溫對Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)位點數(shù)、多態(tài)位點百分數(shù) 的解釋程度分別為48.5%、50%、47.6%、47.6%，且方差分析所顯示的結果均表明模型解釋效果較好（P＜0.05）。

圖4 15個錦雞兒種群鄰接聚類樹Fig.4 Neighbor joining tree of 15 Caragana populations

表9 ISSR 遺傳多樣性各指數(shù)與氣象因子和土壤因子逐步回歸Table9 The regression analysis of ISSR genetic diversity index with meteorological factors and soil factors

3 討 論

小葉錦雞兒與中間錦雞兒在表型性狀上具有極大的相似性，單利用傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法很難從本質差異上對二者進行區(qū)分。目前，應用DNA 分子標記手段對于中間錦雞兒分類學地位的研究，特別是小葉錦雞兒與中間錦雞兒遺傳關系的研究成為人們關注的焦點。侯鑫等［10］基于ITS序列和trnl－F序列探討小葉錦雞兒、中間錦雞兒和檸條錦雞兒的種間關系，發(fā)現(xiàn)中間錦雞兒的trnl－F 序列與小葉錦雞兒完全一致。趙一之等［15］應用RAPD 技術研究發(fā)現(xiàn)，小葉錦雞兒、中間錦雞兒和檸條錦雞兒不是孤立的3個鐘，而是一個地理漸變群。段永紅等應用RAPD 技術發(fā)現(xiàn)小葉錦雞兒與中間錦雞兒的種間差異不大，有較近的親緣關系［16］。在本研究中，聚類分析的結果表明雖然兩個種之間存在交錯，但能夠明顯的區(qū)分開來。

周海燕等［17］將科爾沁沙地的小葉錦雞兒與毛烏素沙地的中間錦雞兒引種至騰格里沙漠，發(fā)現(xiàn)小葉錦雞兒對極端干旱環(huán)境的適應性不及中間錦雞兒。李進等［18］利用梯度分析法對3 種錦雞兒的解剖結構指標進行分析，表明抗旱性順序為小葉錦雞兒＜中間錦雞兒＜檸條錦雞兒。馬成倉［19］對小葉錦雞兒與中間錦雞兒形態(tài)特性、光合特性、水分代謝特性、光合機構等方面研究二者的生態(tài)適應性，結果表明中間錦雞兒有比小葉錦雞兒更強的生態(tài)適應性，更能適應干旱環(huán)境。

通常來講一個物種擁有較為豐富的遺傳多樣性使其更能夠適應環(huán)境的變化，反之，遺傳多樣性貧乏的物種通常在進化上的適應性就相對較弱。Nei’s基因多樣性指數(shù)與Shannon信息指數(shù)是衡量居群多樣性的最常用指標［20］。本研究中中間錦雞兒種群總的Nei’s基因多樣性指數(shù)與Shannon信息指數(shù)均高于小葉錦雞兒種群，這表明中間錦雞兒種群具有比小葉錦雞兒種群更高的遺傳多樣性，這與中間錦雞兒種群具有更好的生態(tài)適應性相一致。中間錦雞兒種群間的遺傳分化系數(shù)為0.188 1，而小葉錦雞兒種群間的遺傳分化系數(shù)為0.119 0，這表明中間錦雞兒種群內具有更高的遺傳分化，這種高度的遺傳分化使得中間錦雞兒能夠適應不良的環(huán)境，擴展其分布范圍。

氣候條件，特別是降水、溫度會影響到植物的生長狀況和物候，影響植物的開花、結實，以及傳粉、種子的傳播［21－22］，從而影響到基因交流。在內蒙古高原，水－熱組合條件是影響植被分布的主導因素。熱量分布從東到西逐漸升高，而降水量分布則是從東到西逐漸減少，由溫度和降水組成的濕潤度逐漸降低［23］。本研究對從東到西分布15個錦雞兒種群遺傳多樣性各指數(shù)與23個環(huán)境因子進行的相關性分析表明，平均氣溫這一熱量條件對錦雞兒種群的遺傳分化起著重要的作用。

錦雞兒屬起源于第三紀中期，小葉錦雞兒與中間錦雞兒為錦雞兒屬在草原區(qū)形成的水份系列上地理替代類群Ser.microphyllae中的2種。其中小葉錦雞兒分布于外貝加爾、蒙古高原、東北平原和華北等地，是分布于草甸草原與典型草原區(qū)的旱生灌木，中間錦雞兒分布于蒙古南部和內蒙中部，是典型草原區(qū)向荒漠草原區(qū)的過渡類型［24］。本研究的鄰接聚類分析表明，在內蒙古高原小葉錦雞兒和中間錦雞兒的集中分布區(qū)，從典型草原到荒漠草原，15 個種群逐漸聚類，體現(xiàn)了這2個種在分布上的地理漸變性及地理替代性；同時小葉錦雞兒種群與中間錦雞兒種群也出現(xiàn)了交叉，體現(xiàn)出中間錦雞兒與小葉錦雞兒密切的親緣關系，表現(xiàn)出生態(tài)過渡帶物種的分子變異特征，說明生態(tài)過渡性與植物物種遺傳結構過渡性密切相關。作為地理替代種不僅顯示了中間錦雞兒和小葉錦雞兒2個種的同源性，也顯示出其更強的適應性。植物在異質環(huán)境中適應分化，形成了不同的局域種群，保持著與環(huán)境匹配的特征組合，并逐漸積累起對異質環(huán)境和波動環(huán)境的遺傳改變，這是適應現(xiàn)實環(huán)境和潛在變動環(huán)境的基礎［25］。中間錦雞兒和小葉錦雞兒交叉變異是物種適應進化的結果，不僅拓展了自身的生存空間，也維護了當?shù)氐奈锓N多樣性。

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