李凡，謝靜，郝華，黃慧，曾強

(解放軍總醫(yī)院國際醫(yī)學中心, 北京 100853)

·基礎(chǔ)研究·

坎地沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠骨骼肌核轉(zhuǎn)錄因子-2表達和胰島素敏感性的影響

李凡，謝靜，郝華，黃慧，曾強

(解放軍總醫(yī)院國際醫(yī)學中心, 北京 100853)

目的 研究坎地沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠骨骼肌核轉(zhuǎn)錄因子-2(Nrf2)表達和胰島素敏感性的影響。方法 30只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為對照組(C組)、模型組(M組)、坎地沙坦低劑量組(Can1組)、坎地沙坦高劑量組(Can2組)，10只WKY大鼠作為對照組，均給予果糖喂養(yǎng)，Can1組及Can2組分別給予坎地沙坦(0.4 mg/kg、0.8 mg/kg)灌胃干預。實驗第8周末，檢測各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、活性氧(ROS)以及Nrf2的表達水平。結(jié)果 與C 組相比，M組HOMA-IR水平及ROS表達顯著升高，而Nrf2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)；與M組相比，Can2組的ROS生成減少，HOMA-IR下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)；Can1及Can2組的Nrf2表達均較M組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05 、P<0.01)。結(jié)論 坎地沙坦可以通過拮抗AngⅡ減輕AngⅡ誘導的骨骼肌胰島素抵抗和氧化應激。

高血壓；血管緊張素Ⅱ；胰島素抗體；活性氧；大鼠, 近交SHR

胰島素抵抗(IR)是指機體對胰島素的敏感性下降，導致細胞攝取和利用葡萄糖的效率降低的狀態(tài)，是高血壓與2型糖尿病的共同病理生理學基礎(chǔ)[1]。目前，臨床試驗證實，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)可改善高血壓患者的IR，從而降低該人群的2型糖尿病發(fā)病率[2-3]。ARB的這種作用部分源于對于細胞內(nèi)活性氧(ROS)的抑制[4]。核轉(zhuǎn)錄因子-2(Nrf2)是調(diào)控細胞內(nèi)抗氧化反應元件的關(guān)鍵因子，它能抑制內(nèi)源性ROS的過度表達[5]，但目前尚不十分清楚ARB是否通過Nrf2發(fā)揮抗氧化作用。本研究建立自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠胰島素抵抗的動物模型，通過檢測坎地沙坦對其骨骼肌胰島素敏感性的影響，以及骨骼肌細胞內(nèi)Nrf2和ROS的改變，進一步探討坎地沙坦改善骨骼肌細胞胰島素抵抗的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 30只12周齡的清潔級雄性SHR大鼠，體質(zhì)量為(245.6±23.5)g，10只12周齡的清潔級雄性WKY大鼠，體質(zhì)量為(250.9±21.7)g，均購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號SCXK(京)2007-0001。所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將30只SHR大鼠隨機分為模型組(M組)、坎地沙坦低劑量組(Can1組)、坎地沙坦高劑量組(Can2組)，每組10只，另外10只WKY大鼠作為對照組(C組)。

1.2 主要藥物及試劑 坎地沙坦西酯購自天津武田制藥有限公司生產(chǎn)，批號：024A；大鼠胰島素檢測試劑盒購自LINCON公司；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ROS檢測試劑盒購自R&D systems公司；DEPC.H2O、Prime ScriptTMRT試劑盒、SYBR Premix TaqTMⅡ均購自TaKaRa公司；Nrf2抗體、山羊抗鼠IgG-HRP購自SANTA CRUZ公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型及藥物干預 各組大鼠均給予標準大鼠飼料喂養(yǎng)。同時，將果糖結(jié)晶溶于飲用水中，配置10%濃度的果糖溶液，各組大鼠均自由飲用，以誘導胰島素抵抗產(chǎn)生。Can1組及Can2組每日給予坎地沙坦西酯灌胃，劑量分別為0.4 mg/kg和0.8 mg/kg，M組及C組灌服等容量純凈水，每日1次，連續(xù)給藥8周。

1.3.2 血清學指標檢測 第8周末，各組動物空腹12 h后斷頭處死并采集血液標本。4 ℃低溫3000 r/min,15 min分離血清，分別送檢空腹血糖(FBG)、AngⅡ及空腹血清胰島素(FIns)，以上檢測指標均按試劑盒說明方法進行。

1.3.3 骨骼肌標本收集及處理 大鼠斷頭處死后，離斷雙下肢，迅速剪開皮膚，在冰盤上分離股四頭肌，去除肌肉表面脂肪并于冰0.9%氯化鈉溶液中洗凈血液，用濾紙吸干水分后稱重，加入一定量的PBS液，再放入液氮中冷凍。在進行骨骼肌ROS含量測定、熒光定量PCR及Western blot實驗時，隨機切取股四頭肌組織(0.2～0.4 g)稱重后加入蒸餾水，在水浴中用勻漿器制備1∶10的勻漿，3000 r/min,10 min后取上清液作為待測樣本。

1.3.4 ROS含量測定 取一定量的骨骼肌勻漿上清，采用ELISA法，按照試劑盒說明步驟操作，顯色后終止反應，用酶標儀在450 nm波長下測量吸光度(OD值)。以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，用標準物的濃度與OD值繪制出標準曲線的直線回歸公式，將待測樣本的OD值代入公式，計算出待測樣本的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為最終待測樣本ROS含量值。

1.3.5 Western blot檢測 從待測樣本中提取蛋白質(zhì)，BCA測試盒測定各組蛋白質(zhì)濃度。各組取相同質(zhì)量的蛋白，變性后在聚丙烯酰胺凝膠上樣進行電泳，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，目的蛋白Nrf2使用5%BSA封閉，內(nèi)參蛋白GAPDH使用5%脫脂奶粉封閉，加入Nrf2(1∶500)及GAPDH(1∶1000)多克隆抗體，4℃過夜。TBST洗滌6次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗鼠IgG)孵育，ECL顯色，X光片記錄結(jié)果，掃描蛋白條帶的密度并進行分析。以內(nèi)參蛋白GAPDH的密度為基準值1，對比得到各組樣本Nrf2蛋白的表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 通過SPSS12.0統(tǒng)計軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 坎地沙坦對SHR的AngⅡ、FBG、FIns及HOMA-IR的影響 結(jié)果顯示，實驗第8周時，模型組大鼠的FIns及HOMA-IR均較對照組明顯升高(P<0.01)，而坎地沙坦低劑量組及高劑量組大鼠FIns、HOMA-IR均較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01、P<0.05)。與模型組相比，坎地沙坦低劑量組及高劑量組AngⅡ水平有升高趨勢，其中坎地沙坦高劑量組出現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組大鼠之間FBG水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 坎地沙坦對SHR骨骼肌ROS的影響 與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌ROS含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，坎地沙坦低劑量組及高劑量組大鼠骨骼肌ROS均下降，見圖1。

2.3 AngⅡ和坎地沙坦對Nrf2 蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠的Nrf2蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，坎地沙坦低劑量組及高劑量組的Nrf2蛋白表達量有升高趨勢，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)，見圖2，3。

表1 坎地沙坦對SHR血清AngⅡ、FBG、FIns及HOMA-IR的影響

注：C組：對照組,M組：模型組,Can1組：坎地沙坦低劑量組,Can2組：坎地沙坦高劑量組；與C組比較,cP<0.05，bP<0.01;與M組比較,aP<0.05，dP<0.01

3 討論

SHR源于WKY大鼠，是經(jīng)人工多代篩選的遺傳性高血壓大鼠，隨著年齡增加，其高血壓的發(fā)生率幾乎為100%。同時，通過果糖誘導，還可以出現(xiàn)胰島素抵抗和糖耐量異常及脂質(zhì)代謝紊亂。實驗第8周時，模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的FIns及HOMA-IR升高，結(jié)果提示該動物模型具有明確的胰島素抵抗的病理生理特征，達到了我們實驗設(shè)計的目標。

近年來，隨著對活性氧族研究的深入，證實了大量ROS的產(chǎn)生是導致細胞氧化應激損傷的重要機制之一，而氧化應激損害在形成胰島素抵抗的病理生理過程中起重要作用[6]。有研究表明，對于高血壓的個體，細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的分子信號反應能力下降，則只會加重ROS對胰島素信號通路的損害，產(chǎn)生胰島素抵抗。本研究中，觀察到模型組大鼠骨骼肌內(nèi)內(nèi)ROS表達顯著增加，同時HOMA-IR也顯著增加，提示該組大鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗；而給予坎地沙坦干預的大鼠，由于抑制了AngⅡ的作用，ROS表達下降，HOMA-IR也相應下降，胰島素抵抗得到改善。因此，我們認為高血壓個體中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度激活提高了AngⅡ的水平，這在一定程度上影響了骨骼肌細胞內(nèi)的氧化應激平衡，增加了內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生，其原因可能與AngⅡ增加細胞內(nèi)NAD(P)H氧化酶表達有關(guān)[7]。

Nrf2是細胞抗內(nèi)源性氧化應激的重要中樞調(diào)節(jié)者，在細胞介導的抗氧化應激防御反應中具有重要的作用[8]，因此，高血壓狀態(tài)下細胞抗氧化能力下降，以及由此產(chǎn)生的胰島素信號通路損害，很可能與Nrf2的功能異常有關(guān)。

本研究表明，模型組大鼠AngⅡ表達增加會抑制骨骼肌細胞內(nèi)的Nrf2的表達，從而使ROS生成增加，骨骼肌胰島素敏感性下降。給予坎地沙坦干預后，由于抑制了AngⅡ，骨骼肌細胞內(nèi)Nrt2的表達增加，ROS的水平下降，胰島素抵抗得到改善。提示坎地沙坦通過對AngⅡ的抑制上調(diào)了Nrf2的表達，繼而通過Nrf2/ARE途徑發(fā)揮對抗氧化應激的作用，使細胞內(nèi)ROS有所降低，恢復和改善了由于ROS過度增加而損害的胰島素信號傳導途徑，從而使胰島素能發(fā)揮正常的促進細胞攝取葡萄糖的功能。綜上所述，坎地沙坦對SHR骨骼肌胰島素敏感性的保護機制部分來源于減少AngⅡ?qū)rf2表達的抑制作用。

(本文圖1～3見插圖2-1)

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Effects of candesartan on the expression of Nrf2 and insulin sensitivity in the spontaneous hypertension rats

Li Fan,Xie Jing,Hao Hua,Huang Hui,Zeng Qiang

(International Medical Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China)Corresponding author:Zeng Qiang,Email:zq301@126.com

Objective To investigate the effects of candesartan on the expression of Nrf2 and insulin sensitivity of the spontaneously hypertensive rats(SHR)and its possible mechanism.Methods 30 SHR were randomly divided into model group,low dose group and high dose group.10 WKY rats served as control group.All the rats fed with fructose,while the low and high dose group rats accepted candesartan consecutive treatment with the dose of 0.4 mg/kg and 0.8 mg/kg respectively.At the 8th weekend,the insulin resistance index(HOMA-IR),the level of reactive oxygen species(ROS)and the expression of Nrf2 were detected.Results Compared with the control group,the HOMA-IR was significantly increased in the model group(P<0.05),the protein expression of Nrf2 in model group significantly decreased(P<0.01)at the same time while the level of ROS increased significantly(P<0.01).Compared with the model group,the HOMA-IR decreased obviously in the high dose group (P<0.01).The protein expression of Nrf2 in the low dose and high dose group increased significantly (P<0.01,P<0.05) compared with model group,and the level of ROS significantly decreased compared with the model group(P<0.05).Conclusion Candesartan could improve the insulin resistance and oxidative stress by the antagnism effect of AngⅡ in the skeletal muscle cells.

Hypertension;AngiotensinⅡ;Insulin antibodies;Reactive oxygen species;Rats,Inbred SHR

北京市自然科學基金項目(7122171)

李凡，主治醫(yī)師，Email:lifan76@126.com

曾強，研究員，教授,Email:zq301@126.com

R544.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.023

2015-01-26)