葉婷,於琳,劉靳波

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

RASSF1A基因甲基化與肝細(xì)胞癌關(guān)系的Meta分析

葉婷,於琳,劉靳波

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的 探討RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)家庭1A基因(RASSF1A基因)異常甲基化與肝細(xì)胞癌的關(guān)系。方法 檢索國(guó)外PubMed、Embase、Ovid、Web of science、Cochrane Library數(shù)據(jù)庫(kù)和國(guó)內(nèi)的中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(VIP)、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)2014年7月以前的相關(guān)文獻(xiàn)，按納入排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)并提取數(shù)據(jù)。用RevMan5.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用比值比(OR)及95%置信區(qū)間(95%CI)衡量RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肝癌的關(guān)系。結(jié)果 共15篇文獻(xiàn)1 417例患者納入研究，其中肝細(xì)胞癌組710例、對(duì)照組707例。肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A甲基化陽(yáng)性率高于正常肝組織[OR=50.23，95%CI(22.21～113.61)、P<0.05]、癌旁正常組織[OR=7.63，95%CI(3.38～17.22)，P<0.05]及肝硬化組織[OR=17.18，95%CI(2.57～114.91)，P<0.05]。結(jié)論 RASSF1A基因的高甲基化導(dǎo)致該基因的失活，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

肝細(xì)胞癌；DNA 甲基化； RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)家庭1A基因； Meta分析

肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要類型，是最常見(jiàn)的預(yù)后不良惡性腫瘤之一，其發(fā)生率呈上升趨勢(shì)[1]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段過(guò)程，由基因改變和表觀遺傳學(xué)異常共同引起原癌基因激活和抑癌基因失活或丟失。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)失活的主要類型，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化引起的表觀沉默已成為肝癌發(fā)生發(fā)展中遺傳學(xué)改變的關(guān)鍵因素之一[2]。近年有關(guān)DNA甲基化與肝細(xì)胞癌的研究較多，但結(jié)果并不完全一致。2014年8～9月，對(duì)國(guó)內(nèi)外有RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)家族1A基因(RASSF1A基因)甲基化與肝細(xì)胞癌的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，以期為臨床提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

1.1.1 檢索策略 制定檢索策略并進(jìn)行系統(tǒng)全面的計(jì)算機(jī)檢索。檢索范圍包括國(guó)外PubMed、Embase、Ovid、Web of Science、Cochrane Library數(shù)據(jù)庫(kù)以及國(guó)內(nèi)的中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(VIP)、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)。中文檢索詞為RASSF1A基因、肝細(xì)胞癌、甲基化；英文檢索詞為Hepatocellular Carcinoma/HCC/Liver Cancer Carcinoma, Methylation/Methylate/Hypermethylation，Ras association domain family protein 1A/RASSF1A，對(duì)研究設(shè)計(jì)類型限定為case control/incidence，檢索時(shí)間從建庫(kù)截止到2014年6月30日，無(wú)語(yǔ)種限制。同時(shí)輔以文獻(xiàn)追溯，獲取全文。

1.1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)表的關(guān)于RASSF1A基因在肝細(xì)胞癌中甲基化情況研究的一次文獻(xiàn)；②研究對(duì)象為人群，研究類型為病例—對(duì)照研究，病例組均由病理學(xué)確診為肝細(xì)胞癌患者，對(duì)照組為經(jīng)臨床證實(shí)良性肝疾病患者或健康人群；③研究方法相似，即采用DNA甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)基因甲基化情況。④能獲得全文，直接報(bào)告了有效的比值比(OR)及其95%CI，或者可以從文章報(bào)告的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；②文摘、綜述、講座或會(huì)議文章；③標(biāo)本為血清、細(xì)胞或動(dòng)物等非肝臟組織實(shí)驗(yàn)研究；④檢測(cè)方法不明確，資料不完整或數(shù)據(jù)不全不能統(tǒng)計(jì)的研究；⑤無(wú)法獲得全文的文獻(xiàn)。

1.2 資料提取 由兩名評(píng)價(jià)者按照標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)提取表格，獨(dú)立提取符合要求的研究資料。包括第一作者姓名、發(fā)表年份、研究地點(diǎn)、腫瘤的組織學(xué)類型、對(duì)照組來(lái)源、病例組和對(duì)照組的樣本量、平均年齡及性別。通過(guò)討論解決分歧。

1.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)估 由兩名評(píng)價(jià)者按照Cochrane手冊(cè)推薦使用的紐卡斯?fàn)枴滋A量表(NOS)獨(dú)立評(píng)估納入研究的方法學(xué)質(zhì)量。該量表主要從研究人群即病例組與對(duì)照組的定義和選擇、組間可比性、暴露因素的測(cè)量三方面共8個(gè)條目進(jìn)行評(píng)分，滿分9分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)提供的Reviews Manager 5.2(Rev Man 5.2)統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)納入文獻(xiàn)的研究結(jié)果通過(guò)Meta分析方法進(jìn)行合并，繪制森林圖。各個(gè)被納入文獻(xiàn)之間的異質(zhì)性大小用χ2檢驗(yàn)和I2統(tǒng)計(jì)量來(lái)驗(yàn)證。若P≤0.05、I2≥50%則采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并；若P>0.05、I2<50%則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并。進(jìn)行敏感性分析以驗(yàn)證每個(gè)獨(dú)立研究對(duì)總的合并結(jié)果的影響。通過(guò)Begg's測(cè)試以及繪制漏斗圖估計(jì)是否有發(fā)表偏倚。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果及納入文獻(xiàn)情況 初步檢索獲得相關(guān)文獻(xiàn)共87篇，通過(guò)Endnote X6文獻(xiàn)管理軟件去重后獲得文獻(xiàn)49篇，再通過(guò)閱讀文題和摘要排除綜述、會(huì)議文章、與主題不相關(guān)的文獻(xiàn)以及相同作者相似內(nèi)容文獻(xiàn)等獲得18篇，進(jìn)一步閱讀全文，未達(dá)到納入標(biāo)準(zhǔn)的3篇，最終納入文獻(xiàn)共15篇[3～17]。入選病例1 417例，其中肝細(xì)胞癌組710例，對(duì)照組707例(包括癌旁組354例、肝硬化111例、肝炎組39例及正常組織136例)。納入文獻(xiàn)基本情況見(jiàn)表1。

表1 RASSF1A基因納入Meta分析文獻(xiàn)的基本特征及質(zhì)量評(píng)分

2.3 統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

2.3.1 肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織RASSF1A基因甲基化率比較 11篇文獻(xiàn)[3～9,11，12,15,16]報(bào)道此內(nèi)容，肝細(xì)胞癌組450例、正常肝組織對(duì)照組136例，其中分別有372例(83.7%)患者肝細(xì)胞癌組織和11例(8.1%)正常肝組織檢測(cè)到RASSF1A基因甲基化。異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果P=0.49、I2=0%，顯示結(jié)果無(wú)異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中RASSF1A基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=50.23，95%CI(22.21～113.61)，P<0.05]，肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A基因甲基化率明顯高于正常肝組織，詳見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌組織與正常肝組織中RASSF1A基因甲基化的Meta分析

2.3.2 肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織RASSF1A基因甲基化率比較 10篇文獻(xiàn)[3～6,9～12,14,16]報(bào)道此內(nèi)容，肝細(xì)胞癌426例、癌旁組織354例，其中分別有374例(87.8%)患者肝細(xì)胞癌組織和196例(55.4%)癌旁組織檢測(cè)到RASSF1A基因甲基化。異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果P=0.005、I2=64%，顯示結(jié)果有異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中RASSF1A基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=7.63，95%CI(3.38～17.22)，P<0.05]，腫瘤組織中RASSF1A基因甲基化率明顯高于癌旁組織，詳見(jiàn)圖2。

圖2 肝癌組織與癌旁組織中RASSF1A基因甲基化的Meta分析

2.3.3 RASSF1A基因在HCC腫瘤組織和肝硬化組織中的甲基化比較 5篇文獻(xiàn)[4,12～15]報(bào)道此內(nèi)容，肝細(xì)胞癌280例、肝硬化111例，其中分別有374例(87.8%)患者肝細(xì)胞癌組織和196例(55.4%)肝硬化組織檢測(cè)到RASSF1A基因甲基化。異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果P=0.00 09、I2=79%，顯示結(jié)果有異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中RASSF1A基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=17.18，95%CI(2.57～114.91)，P<0.05]，肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A基因甲基化率明顯高于肝硬化組織，詳見(jiàn)圖3。

圖3 肝癌組織與肝硬化組織中RASSF1A基因甲基化的Meta分析

2.4 發(fā)表偏倚評(píng)估 漏斗圖圖形基本呈對(duì)稱倒立分布，說(shuō)明發(fā)表偏倚對(duì)研究結(jié)果無(wú)影響。

2.5 敏感性分析 對(duì)I2>50%的結(jié)果行敏感性分析，每次減少一篇文獻(xiàn)估計(jì)單個(gè)獨(dú)立研究對(duì)Meta分析的影響。剔除后結(jié)果前后無(wú)明顯差異，提示Meta分析結(jié)論較穩(wěn)定可信。

3 討論

抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的表觀遺傳失活被認(rèn)為是肝癌等多種癌癥發(fā)生的重要機(jī)制。RASSF1A基因定位于3p21.3，在細(xì)胞周期調(diào)控、微管穩(wěn)定、細(xì)胞黏附和細(xì)胞凋亡中起著重要作用[18]。RASSF1A作為抑癌基因的功能已被體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)所證實(shí)， 在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)可降低細(xì)胞軟瓊脂克隆形成及裸鼠的致瘤性[19]。RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化導(dǎo)致的基因缺失是癌癥形成的頻發(fā)事件，已在包括肝癌等多種類型的腫瘤中被證實(shí)。其作用機(jī)制是同源異位基因HOXB3與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B基因結(jié)合使其高表達(dá)，同時(shí)多梳抑制復(fù)合物2與癌基因MYC相互作用促進(jìn)DNMT3B結(jié)合于RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致高甲基化及表達(dá)沉默促進(jìn)腫瘤形成。RASSF1A基因異常甲基化與肝細(xì)胞癌的關(guān)系日益受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注，然而文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論存在一定分歧。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A基因甲基化率高于正常肝組織、肝硬化組織和癌旁組織。肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展經(jīng)過(guò)肝炎、肝硬化再到肝癌的多步驟演變，RASSF1A基因甲基化率在此過(guò)程中逐漸增高。

檢驗(yàn)研究間的異質(zhì)性是Meta分析的重要內(nèi)容之一。本系統(tǒng)評(píng)價(jià)對(duì)納入研究是否具有異質(zhì)性做了詳細(xì)分析，根據(jù)組間異質(zhì)性存在與否選擇隨機(jī)效應(yīng)或固定效應(yīng)模型。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，另行敏感性分析，剔除單個(gè)獨(dú)立研究后觀察結(jié)果前后并無(wú)顯著性變化，說(shuō)明本次Meta分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。本研究尚有不足之處，包括檢索到的文獻(xiàn)不夠全面，檢索范圍局限在公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)，對(duì)于未公開(kāi)發(fā)表的研究存在漏檢的可能；檢索語(yǔ)種僅限于中文和英文，可能漏檢其他語(yǔ)種的研究；納入文獻(xiàn)人種多為肝細(xì)胞癌多發(fā)的東亞地區(qū)等。因此，本系統(tǒng)評(píng)價(jià)納入研究存在選擇性偏倚、文獻(xiàn)收集性偏倚的可能。由于Meta分析評(píng)價(jià)方法本身的不足與納入研究間的差異，要更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)抑癌基因RASSF1A甲基化與肝細(xì)胞癌的關(guān)系，尚需要納入更全面、嚴(yán)謹(jǐn)，更高質(zhì)量的病例對(duì)照研究進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果。

總之，本系統(tǒng)評(píng)價(jià)表明抑癌基因RASSF1A高甲基化與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)，基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化誘導(dǎo)的表達(dá)失活在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

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四川省教育廳科研項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目(12ZA243)。

劉靳波

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.034

R735.7

B

1002-266X(2015)06-0085-04

2014-11-12)