劉帥，梁鐵軍，王愛(ài)武，高桂新

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；2山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院)

貓爪草皂苷對(duì)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCCLM3及MHCC97-H增殖的影響

劉帥1,2，梁鐵軍2，王愛(ài)武2，高桂新2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；2山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院)

目的 觀察貓爪草皂苷(RRTS)對(duì)人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97-H增殖的影響。方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞分為兩組。RRTS組分別采用50、100、200、400 μg/mL 濃度的RRTS干預(yù)，每濃度5個(gè)復(fù)孔；5-FU組采用50 μg/mL 的5-FU干預(yù)，作用后72 h采用MTT法測(cè)定兩組細(xì)胞增殖情況，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果 RRTS組各濃度對(duì)HCCLM3、MHCC97-H腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，隨RRTS濃度增加，抑制作用明顯增強(qiáng)，呈量—效依賴關(guān)系(P均<0.05)；400 μg/mL 對(duì)兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與5-FU組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。倒置顯微鏡下觀察，兩種細(xì)胞株經(jīng)RRTS處理后，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞相互分離，貼壁脫落，出現(xiàn)片狀無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)，并見(jiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞變圓，體積減小，核固縮，核顏色加深，折光性增強(qiáng)，隨著RRTS劑量增加，這種變化更加明顯。400 μg/mL濃度的RRTS對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與5-FU組相似。結(jié)論 RRTS對(duì)HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用。

貓爪草；皂苷；肝細(xì)胞癌；HCCLM3細(xì)胞；MHCC97-H細(xì)胞；細(xì)胞增殖

據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌在世界范圍惡性腫瘤發(fā)病率中排第6位，病死率排第3位[1]。肝癌具有高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的特性，其治療是世界性難題，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因[2～4]。抑制肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)患者生存期是目前臨床上亟需解決的重要課題[5，6]。貓爪草是臨床上常用的抗腫瘤中藥之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)其有較好的抗腫瘤活性。目前已有貓爪草皂苷(RRTS)抑制乳腺癌、結(jié)腸癌等的研究報(bào)道，但其對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移影響的相關(guān)報(bào)道鮮見(jiàn)。2015年4～5月，我們觀察了RRTS對(duì)人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株體外增殖及細(xì)胞形態(tài)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株 HCCLM3購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97-H由山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。藥物及試劑： 貓爪草(毛茛科毛茛屬植物小毛茛的干燥塊根)由山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院草藥房提供，5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)，二苯基四氮唑溴鹽(MTT，美國(guó)AMRESCO公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)MP Biomedicals公司)，RPMI-1640(美國(guó)Cellgro公司)，新生牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Invitrogen公司)；青鏈霉素混合液(美國(guó)Invitrogen公司)。主要儀器：Hera Cell 240型CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；IX71奧林巴斯倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；SW-CJ-2FD醫(yī)用型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；MDF-U53V型醫(yī)用低溫箱(日本SANYO公司)；600A型醫(yī)用低速離心機(jī)(安新縣白洋離心機(jī)廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RRTS的制備 精密稱取干燥的貓爪草100 g，粉碎成粗顆粒， 置回流提取器中，用 85%乙醇提取 3次，提取液抽濾，經(jīng)濃縮后分別用乙醚、水飽和正丁醇萃取，水飽和正丁醇萃取液再用0.1 mol/L NaOH萃取2次，正丁醇液回收至干，得總皂苷，將所得皂苷用適量蒸餾水溶解，G6 漏斗濾過(guò)除菌，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)基[含10% 胎牛血清、1% 雙抗(青霉素/鏈霉素) ],置于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% 的CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)、傳代。

1.2.3 不同濃度RRTS對(duì)HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞增殖的影響的觀察 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞接種于96 孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。RRTS組分別加入50、100、200、400 μg/mL濃度RRTS， 每一濃度設(shè)5個(gè)平行孔，另設(shè)調(diào)零孔、空白對(duì)照孔；5-FU組加入5-FU 50 μg/mL。各組均培養(yǎng)72 h后加入MTT 溶液(用生理鹽水配制) 20 μL( 5 mg/mL)培養(yǎng)，4 h后倒盡培養(yǎng)液，各孔加DMSO 150 μL， 輕輕振動(dòng)后 室溫置30 min，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)570 nm) 測(cè)定各孔的光密度(OD) 值，取每組平均OD 值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率(%) = (1-加藥孔平均OD 值/對(duì)照孔平均OD值)×100%。

1.2.4 不同濃度RRTS對(duì)HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞形態(tài)影響的觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)、接種于6孔板中，調(diào)整密度為5×105/孔，待24 h細(xì)胞貼壁開(kāi)始生長(zhǎng)后換液，5-FU組加入50 μg / mL的 5-FU；RRTS組分別加入50、100、200、400 μg/mL濃度的RRTS培養(yǎng)液。48 h后于倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 RRTS對(duì)HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞株增殖的抑制作用 5-FU組和RRTS組細(xì)胞抑制率見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，50、100、200、400 μg/mL的RRTS對(duì)HCCLM3、MHCC97-H生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，且隨RRTS濃度增加，抑制作用明顯增強(qiáng)，呈量—效依賴關(guān)系，但RRTS組各劑量間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。400 μg/mL RRTS組對(duì)HCCLM3、MHCC97-H 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與5-FU組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 5-FU組和各RRTS組細(xì)胞抑制率比較

注：與5-FU組比較，▲P<0.05；RRTS組各劑量組之間比較，*P<0.05

2.2 RRTS對(duì)HCCLM3、MHCC97-H腫瘤細(xì)胞株形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下可見(jiàn)，RRTS組兩種細(xì)胞株經(jīng)RRTS處理48 h后，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞相互分離，貼壁脫落，出現(xiàn)片狀無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)，并見(jiàn)細(xì)胞碎片，細(xì)胞變圓，體積減小，核固縮，核顏色加深，折光性增強(qiáng)；隨RRTS劑量增加，這種變化更加明顯。400 μg/mL濃度的RRTS對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與5-FU組相似。

3 討論

MHCC97-H細(xì)胞來(lái)源于肝癌患者的肝內(nèi)播散灶，是通過(guò)逐級(jí)篩選獲得的具有高轉(zhuǎn)移潛能的單克隆細(xì)胞株，符合一般肝癌的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征，具有我國(guó)肝癌細(xì)胞的典型基本生物學(xué)性狀。HCCLM3肝癌細(xì)胞株是以MHCC97-H 肝癌細(xì)胞株為基礎(chǔ)獲得的高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株[7]，具備肝癌細(xì)胞特點(diǎn)和良好的自發(fā)性轉(zhuǎn)移特性[8]。兩種細(xì)胞株均是研究藥物抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移侵襲等細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的良好模型。

前期工作中我們采用系統(tǒng)溶劑法提取了RRTS，用MTT和SRB兩種方法進(jìn)行了RRTS對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549、人白血病細(xì)胞株HL-60及人宮頸癌細(xì)胞株Hela共3種腫瘤細(xì)胞增殖影響的體外研究，結(jié)果證實(shí)RRTS有較好的抗腫瘤效果[9，10]。 貓爪草性味甘、辛、溫，歸肝、肺經(jīng)，具有散結(jié)、消腫之功效，主治瘰疬結(jié)核、疔瘡、蛇咬傷等，民間主要用于治療頸淋巴結(jié)核(俗稱老鼠瘡)、腮腺炎(俗稱癢腮)；貓爪草單、復(fù)方煎劑等對(duì)惡性淋巴瘤、甲狀腺瘤、乳腺腫瘤、肺癌及婦科子宮肌瘤等均有治療效果。民間亦有人采用貓爪草治療子宮頸癌，配白頭翁治療癭瘤[11]，配半枝蓮、白英治療胃癌、食道癌，配葶藶子治療癌性腹水[12]。

本研究結(jié)果顯示RRTS對(duì)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97-H增殖均有抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，RRTS可引起人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞形態(tài)和顏色的改變以及成片脫落死亡，進(jìn)一步證實(shí)了RRTS體外對(duì)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞具有抑制作用。高于貓爪草抗腫瘤的機(jī)制目前尚不十分明確，但有較多報(bào)道。全山叢等[15]認(rèn)為其可能通過(guò)調(diào)節(jié)患者體內(nèi)Cu/Zn平衡而發(fā)揮抗癌效果；周立等[16]發(fā)現(xiàn), 貓爪草中的軟脂酸具有較強(qiáng)誘生腫瘤壞死因子(TNF)的作用；陳彥等[17]報(bào)道，貓爪草中的多糖蛋白復(fù)合物RTG-Ⅲ能夠誘導(dǎo)脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞HL-60的抑制作用，推測(cè)貓爪草多糖通過(guò)增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)的功能來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用；孟祥虎等[18]推測(cè)高濃度RRTS可通過(guò)促進(jìn)mfn2基因表達(dá)而抑制MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；周清安等[19～21]認(rèn)為RRTS具有明顯抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，下調(diào)Bcl-2、Bcl-2/Bax，增加Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一，其引起凋亡的途徑可能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加有關(guān)；童曄玲等[13]推測(cè)RRTS抑制A549細(xì)胞增殖機(jī)制可能與誘導(dǎo)凋亡、G0/G1期阻滯有關(guān)；尹春萍等[22]認(rèn)為RRTS體外抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制DNA的合成，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂。其他機(jī)制尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。皂苷類成分復(fù)雜，RRTS中對(duì)人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株起抑制作用的確切的有效成分及其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還有待深入研究。

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Study on the inhibition of extracts in Radix Ranunculi Ternati on cell HCCLM3 and MHCC97-H of liver cancer metastasis

LIUShuai1,LIANGTie-jun,WANGAi-wu,GAOGui-xin

(1ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective To study the effect of the saponins on the HCCLM3 and MHCC97-H proliferation of liver cancer metastatic cells .Methods HCCLM3 and MHCC97-H of high metastatic hepatocellular carcinoma cell lines were used as the study object to detect the impact of concentrations of the saponins on the growth of liver cancer cells by MTT and a phase-contrast microscope was used to observe the impact of the saponins on hepatoma cell morphology. Results The cell survival rate of the saponins treatment group reduced compared with that of the control group.This effect becomes more obvious with the increasing concentration of the drug. The cell density reduced after the treatment of the saponins through the observation under the Phase-contrast microscope. Conclusion The saponins has an inhabitation effect on the growth of HCCLM3 cells and MHCC97-H cells.

Radix Ranunculi Ternati；saponin；hepatocellular carcinoma HCCLM3 cell；MHCC97-H cell；proliferation

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2012HM070)

劉帥(1988-) ，男，碩士，研究方向?yàn)橹兴幍乃幚砼c實(shí)驗(yàn)。E-mail:liushuai523518@163.com

王愛(ài)武(1966-)，女，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幒侠響?yīng)用研究。E-mail:wangaw66@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.003

R735.7

A

1002-266X(2015)06-0008-03

2014-10-22)