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（海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?70228）

印楝素是印楝植物組織細(xì)胞產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，具有高效殺蟲、拒食、抑制生長(zhǎng)發(fā)育、胃毒、忌避、抑制呼吸、抑制昆蟲激素分泌、降低昆蟲生育能力及殺滅微生物的作用[2－6]，已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保、化妝品及食品中廣泛應(yīng)用[7－8]。由于印楝素應(yīng)用范圍廣，高效低毒，是新一代最具有開發(fā)價(jià)值的生物農(nóng)藥及食品防腐劑，具有廣闊應(yīng)用前景[9]。植物中印楝素含量低，種子中含量最高，也僅0.3%左右[10]。為了開發(fā)利用印楝素，需要通過(guò)植物純化或者人工合成[11－12]得到印楝素。植物純化存在植材耗量大、得率低等缺點(diǎn)，人工合成存在耗時(shí)長(zhǎng)，得率僅0.000 15%[13]，在實(shí)際生產(chǎn)中難以實(shí)現(xiàn)，因而不具備現(xiàn)實(shí)意義。

通過(guò)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是目前活性物質(zhì)生產(chǎn)中的一條重要途徑，經(jīng)此途徑得到的目標(biāo)產(chǎn)物與原植株相比具有產(chǎn)出速度快、產(chǎn)量高，生產(chǎn)環(huán)境條件易控制，可周年生產(chǎn)等[14]。印楝懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的目的是為了得到大量的印楝素，是其工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，而生物反應(yīng)器是實(shí)現(xiàn)這一步的前提條件之一。生物反應(yīng)器相對(duì)搖瓶而言，工作體積大，單位生產(chǎn)能力高，可以更好地控制反應(yīng)系統(tǒng)；生物反應(yīng)器可以放大，能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。而國(guó)內(nèi)相應(yīng)的研究主要集中在印楝素的提取分離、作用效果、作用機(jī)制等方面，梁軍等[15]對(duì)印楝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立及懸浮培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，但未見對(duì)其組織細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)方面的研究報(bào)道。為此，筆者等探索接種量與通氣比對(duì)印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及印楝素產(chǎn)量影響，以期為印楝懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 印楝懸浮細(xì)胞 印楝懸浮細(xì)胞，來(lái)自于印楝籽源經(jīng)固體培養(yǎng)基多次繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的生長(zhǎng)旺盛、色澤嫩黃、疏松易碎的組織，接種于種子培養(yǎng)基。將續(xù)代穩(wěn)定的印楝懸浮細(xì)胞按一定接種量轉(zhuǎn)入500mL三角瓶，25℃培養(yǎng)8d后，得到足量的生長(zhǎng)旺盛的印楝懸浮細(xì)胞作為種子細(xì)胞。

1.1.2 發(fā)酵設(shè)備和藥品 發(fā)酵罐為5L 氣升式發(fā)酵罐，上海寶興生物設(shè)備工程有限公司；所有藥品均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

1） 種 子 培 養(yǎng) 基。 培 養(yǎng) 基 為 MS ＋BA2.0mg／L＋蔗糖40g／L，pH 6.0。2）發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為MS＋BA 2.0 mg／L＋蔗糖40g／L，pH6.0，發(fā)酵至第8天加入已優(yōu)化的組合誘導(dǎo)子（水楊酸92.00 mg／L、萘 乙 酸6.0 mg／L、殼 聚 糖54.0mg／L和吲哚丁酸3.0mg／L）。

1.2 培養(yǎng)方法

發(fā)酵罐反應(yīng)器經(jīng)空罐消毒后，裝入3L 發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 6.0，經(jīng)消毒后接入一定量的印楝懸浮細(xì)胞種子液。培養(yǎng)期間通入一定量的無(wú)菌空氣，保持溫度（25±2）℃，黑暗培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞干重測(cè)定

將培養(yǎng)好的細(xì)胞懸浮液，搖勻后取100 mL，3 000r／min離心20 min，沉淀用蒸餾水清洗2次，50℃烘干至恒重后稱量，即為細(xì)胞干質(zhì)量，生長(zhǎng)速率以g DW／（L·d）表示。

1.4 印楝素的提取與測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法用甲醇萃取干細(xì)胞中的印楝素。萃取液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，清液采用HPLC法檢測(cè)樣品中印楝素的含量。色譜條件：C－18柱，乙腈∶水（10∶90）為流動(dòng)相，流速0.5mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，柱溫30℃。以1g干愈傷組織中印楝素（mg）表示印楝素含量，產(chǎn)量以mg／L 表示，比產(chǎn)率以mg／（g·d）表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 與Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量與通氣比對(duì)印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素產(chǎn)量的影響

從表中看出，當(dāng)固定通氣比為0.2vvm，不同接種量條件下印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素合成的變化情況。當(dāng)接種量為20～60g FW／L時(shí)，印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和印楝素的比產(chǎn)率隨接種量的增大而增大，接種量為60g FW／L 時(shí)達(dá)最大，分別為0.75 g DW／（L·d）和0.55mg／（g·d）；當(dāng)接種量達(dá)80g FW／L時(shí)，印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和印楝素的比產(chǎn)率又開始下降，細(xì)胞干重和印楝素含量降低。因此，綜合考慮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素的累積，接種量為60g FW／L較適宜。

從表中還可知，當(dāng)接種量為60g／L 時(shí)，不同通氣比條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素的累積隨通氣比的增大呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)通氣比為0.20vvm時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)量最大和印楝素積累量最多，分別為11.41g DW／L 和8.32 mg／g；當(dāng)繼續(xù)增大通氣比時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，印楝素累積降低。因此，適宜的通氣比為0.2vvm。

表 不同接種量與通氣比條件下印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與印楝素的產(chǎn)量Table Growth of A.indicasuspension cell and azadirachin yield under different inoculum size and compression－ventilation ratio

2.2 發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基pH 變化及加入誘導(dǎo)子后的印楝素產(chǎn)量

從圖1看出，接種量60g／L、通氣比為0.2vvm時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH 呈先降后升的變化趨勢(shì)。在發(fā)酵9d左右達(dá)最低值?？赡苁请S著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，培養(yǎng)基中的糖被利用，產(chǎn)生有機(jī)酸，使pH 值降低；隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，pH 又逐漸回升，可能與后期產(chǎn)生的一些堿性物質(zhì)有關(guān)。整個(gè)發(fā)酵期間，pH 變化范圍在4.8～6.4。

從圖1還可知，加入誘導(dǎo)子2d內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)印楝素累積量逐漸增加，在誘導(dǎo)子加入后48h，印楝素累積量達(dá)最大，為8.32 mg／g，此后隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，印楝素累積量略有下降，但降幅很小。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及印楝素的產(chǎn)量變化

從圖2可知，在發(fā)酵過(guò)程中印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)基本呈S型曲線。與搖瓶發(fā)酵相比，印楝懸浮細(xì)胞在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)略差，在培養(yǎng)9d 時(shí)為搖瓶的90%左右，可能的原因是在發(fā)酵罐中的條件還沒有達(dá)到最佳狀態(tài)，特別是光照，與搖瓶培養(yǎng)存在差異。糖類物質(zhì)消耗，發(fā)酵罐中印楝懸浮細(xì)胞對(duì)糖類物質(zhì)的利用并不完全，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基中未被利用的蔗糖為0.8%～1.0%?？梢?，在發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)可以適當(dāng)降低糖類物質(zhì)的濃度。添加復(fù)合誘導(dǎo)子的細(xì)胞生長(zhǎng)與底物消耗與對(duì)照相比，在誘導(dǎo)子加入后略有差異（P＞0.05）。從圖2還可知，在細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)期的末期（第8天）添加復(fù)合誘導(dǎo)子，印楝素的積累效果極顯著。添加誘導(dǎo)子的24h后印楝素產(chǎn)量最，達(dá)94.78mg／L，與對(duì)照相比差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的pH 變化及加入誘導(dǎo)子后印楝素的產(chǎn)量Fig.1 Azadirachin yield of pH variation and inductor during the fermentation process

圖2 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及印楝素的產(chǎn)量Fig.2 Growth dynamic and azadirachtin yield of A.indica suspension cells during the fermentation process

3 結(jié)論與討論

1）接種量和通氣比是影響發(fā)酵罐中懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累最重要的2個(gè)因素。接種量過(guò)小，不能充分利用發(fā)酵液中的有效成分，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞增量小，要達(dá)到最大生長(zhǎng)量，會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，降低設(shè)備的利用率。接種量過(guò)大，細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)不利；通氣比大小影響發(fā)酵液的傳質(zhì)和傳熱。通氣比低，發(fā)酵液的傳熱傳質(zhì)效果不好，影響懸浮細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而影響懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)和印楝素的合成；通氣比過(guò)大，容易導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)量和印楝素的合成。

2）在細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)期加入誘導(dǎo)子對(duì)產(chǎn)物的積累效果不同。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)期一般包括延遲期、指數(shù)期和穩(wěn)定期3個(gè)時(shí)期，不同時(shí)期加入刺激劑誘導(dǎo)效果不同。Cu2＋對(duì)紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇形成的影響最大的是生長(zhǎng)指數(shù)期末期，在指數(shù)生長(zhǎng)期末紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)處理具有最強(qiáng)的反應(yīng)能力[16]。研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸、萘乙酸、殼聚糖和吲哚丁酸組合的復(fù)合誘導(dǎo)子對(duì)印楝素的積累具有顯著效果，且最適添加時(shí)期為細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期末期（另文發(fā)表）。誘導(dǎo)子刺激細(xì)胞合成最大目的產(chǎn)物所需要的時(shí)間各不相同，有的時(shí)間較長(zhǎng)，有的時(shí)間較短[17]。本研究加入復(fù)合誘導(dǎo)子后獲得最大印楝素含量所需的時(shí)間為48h，與Prakash等人[18]在3L的生化發(fā)酵罐中利用復(fù)合誘導(dǎo)子誘導(dǎo)印楝懸浮細(xì)胞積累最大量印楝素所需時(shí)間一致。

3）通過(guò)5L 氣升式發(fā)酵罐研究印楝懸浮細(xì)胞初步擴(kuò)大培養(yǎng)，探明了適宜的接種量和通氣比分別為60g／L和0.2vvm，在此條件下，懸浮培養(yǎng)基質(zhì)中的pH 變化呈先降后升趨勢(shì)，細(xì)胞干重和印楝素產(chǎn)量分別為11.41g DW／L 和8.32 mg／g，添加復(fù)合誘導(dǎo)子后24h，印楝素產(chǎn)量最大值（94.78 mg／L）。在反應(yīng)器中，印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素產(chǎn)量呈偶聯(lián)型。

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