張 宇，夏 志，劉 刊，李明偉，田亞婷，袁 玲，楊玉蓮

（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，貴州省化學(xué)化工實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，貴州 畢節(jié)551700）

毒死蜱屬有機(jī)磷農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑，被用于水稻、小麥、蔬菜、水果等多種咀嚼式害蟲(chóng)的防治，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活中應(yīng)用十分廣泛[1－2]。但毒死蜱進(jìn)入人體會(huì)產(chǎn)生很大的傷害[3－5]。因此，毒死蜱一直是食品和農(nóng)業(yè)環(huán)境中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重點(diǎn)。傳統(tǒng)的毒死蜱殘留檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[7]以及其與質(zhì)譜的聯(lián)用[8]等技術(shù)，這些方法具有分析靈敏度高、檢測(cè)限低和定性定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但所需的儀器設(shè)備大型昂貴、樣品前處理過(guò)程繁瑣、檢測(cè)時(shí)耗久和不能實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)。且常規(guī)檢測(cè)中的提取、凈化、濃縮及檢測(cè)等過(guò)程中，每一步驟所用的操作方法、硬件設(shè)施、人員技術(shù)熟練程度乃至實(shí)驗(yàn)室的管理水平等都對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大的影響，從而限制了其應(yīng)用前景，不能快速有效地在野外進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。

生物傳感器技術(shù)作為近年來(lái)檢測(cè)農(nóng)藥殘留的新方法，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有更好的準(zhǔn)確性和特異性，有選擇性好、響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、樣品處理要求較低、可微型化、便于利用計(jì)算機(jī)收集和處理數(shù)據(jù)以及不會(huì)或很少損傷樣品或造成污染等特點(diǎn)。

生物傳感器的響應(yīng)性能很大程度依賴于傳感器的構(gòu)建，只有設(shè)計(jì)構(gòu)造出性能優(yōu)異的傳感器才有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值和意義。碳納米材料具有化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、導(dǎo)電性和生物相容性優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)殡娀瘜W(xué)反應(yīng)提供充足的活性位點(diǎn)[9－10]，石墨烯（GO）因其表面豐富的親水基團(tuán)和其特殊的結(jié)構(gòu)，可以作為分散劑分散碳納米管（CNTs）制備出水溶性和分散性較好的碳納米管－石墨烯（CNTs－GO）納米復(fù)合物。并將其作為載體構(gòu)建以乙酰膽堿酯酶（AChE）為催化活性中心的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)傳感器，促進(jìn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)、在線和快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

乙酰膽堿酯酶（AChE，TypeC3389－500UN，425.94units／mg，Sigma－Aldrich 公 司），氯 化 乙 酰膽堿（阿拉丁試劑），毒死蜱標(biāo)品（湖北仙隆化工股份有限公司），碳納米管（CNTs），石墨烯（GO）（南京先鋒納米科技股份有限公司），氯化鉀、磷酸和氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Al2O3粉末（上海辰華試劑廠）；試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），掃描電鏡（S－4800，Hitachi，日本），精密型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠），5L、10L、25L、50L 微量進(jìn)樣器（寧波市鎮(zhèn)海玻璃廠）。

1.2 納米復(fù)合材料的制備

將1∶1的CNTs和GO 水溶液置于超聲波中，利用超聲波的震蕩作用，使兩種物質(zhì)分散并融合，最后得到混合均勻的CNTs－GO 納米復(fù)合物。

1.3 電極的前處理及傳感器的制備

電極修飾前，在麂皮上用粒徑0.05m 的Al2O3粉懸濁液將玻碳電極（GCE）拋光成鏡面，再用二次水清洗干凈，分別在乙醇和二次水中超聲清洗5min，室溫下自然晾干。然后先將CNTs－GO 的納米復(fù)合物滴涂在電極表面，再將AChE 固定在納米復(fù)合材料表面，在冰箱內(nèi)靜置24h，讓其晾干，即制得AChE／CNTs－GO／GCE。同法制備CNTs／GCE和GO／GCE。

1.4 測(cè)定方法

試驗(yàn)均采用三電極系統(tǒng)：修飾的GCE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑電極（Pt）為對(duì)電極，所有試驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。具體的電極構(gòu)造及實(shí)驗(yàn)原理見(jiàn)圖1。

圖1 三電極系統(tǒng)電極構(gòu)造及原理Fig.1 The schematic diagram of the electrode structure and principle

1.4.1 底物最適濃度的測(cè)定 改變底物濃度對(duì)酶納米復(fù)合結(jié)構(gòu)生物傳感器的反應(yīng)速率有很大影響。試驗(yàn)采用循環(huán)伏安法考察傳感器在反應(yīng)體系中對(duì)底物氯化乙酰膽堿濃度的選擇，在反應(yīng)體系中，逐漸增加氯化乙酰膽堿的量，然后再逐一進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。

1.4.2 pH及孵育時(shí)間的優(yōu)化 酶的活性受pH值影響較大，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)影響AChE 酶蛋白的構(gòu)象。同時(shí)pH 還會(huì)影響氯化乙酰膽堿與AChE的解離狀態(tài)、酶與底物形成的中間產(chǎn)物解離速度以及酶活性。因此，采用計(jì)時(shí)電流法考察傳感器在反應(yīng)體系中pH 值的最優(yōu)值。分別配制0.1mol／L、pH 4.0～8.5的PBS，測(cè)定底物氯化乙酰膽堿的響應(yīng)電流。

毒死蜱與AChE 作用使酶失活需要一定的時(shí)間才能達(dá)到平衡，這段時(shí)間被稱為抑制時(shí)間。只有當(dāng)酶被一定濃度毒死蜱抑制完全后才能對(duì)毒死蜱的抑制作用進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而確定其濃度。對(duì)抑制時(shí)間進(jìn)行選擇，采用循環(huán)伏安法考察傳感器在1.43 μmol／L毒死蜱中抑制不同時(shí)間的響應(yīng)。

1.4.3 傳感器對(duì)毒死蜱的電化學(xué)響應(yīng) 分別向反應(yīng)體系中加入事先配置好的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液，抑制合適時(shí)間后，加入底物，反應(yīng)徹底后利用循環(huán)伏安法測(cè)定修飾電極對(duì)農(nóng)藥毒死蜱的響應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CNTs和CNTs－GO的微型形貌

從圖2－a中可見(jiàn)，單純的CNTs管徑分布均勻，相互纏繞在一起，呈明顯的卷曲狀，有團(tuán)簇現(xiàn)象。而加入GO 后，表面存在彎曲褶皺，呈現(xiàn)石墨烯的固有特征，CNTs從GO片層中穿過(guò)，又由于GO 與CNTs有較強(qiáng)的π－π鍵作用，由此形成一種3D 立體的疏松多孔夾層結(jié)構(gòu)（圖2b），這種結(jié)構(gòu)能使電極的比表面積大幅提升，能為電化學(xué)反應(yīng)提供充足的活性位點(diǎn)和反應(yīng)場(chǎng)所，促進(jìn)電子傳遞，從而提高整個(gè)納米復(fù)合材料修飾電極的催化性能。

圖2 碳納米管（a）和碳納米管／石墨烯（b）的微型形貌Fig.2 SEM morphology of CNTs（a）and CNTs－GO（b）

2.2 電化學(xué)表征

從不同材料修飾的玻碳電極在0.1mol／L、pH 7.5的磷酸緩沖液（PBS）中的循環(huán)伏安曲線（圖3）看出，裸玻碳電極（a曲線）的氧化電流強(qiáng)度很小，且無(wú)明顯的出峰；b曲線氧化電流強(qiáng)度有了明顯增大，且在－0.1V 左右有一對(duì)明顯的氧化還原峰，為碳納米管的特征峰[11－12]；雖然GO 由于具有豐富的親水基團(tuán)水溶性較好，但c曲線導(dǎo)電性能無(wú)還原石墨烯強(qiáng)，電流強(qiáng)度較b曲線有所下降；d曲線電流強(qiáng)度比c、b曲線強(qiáng)，這是因?yàn)镚O 的加入大幅度提升了電極的比表面積，降低了CNTs的團(tuán)聚，顯著提高了電極的電化學(xué)性能。

圖3 不同修飾電極的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammetry curve of different modified electrodes

2.3 反應(yīng)體系底物的最適濃度

從圖4看出，0.6V 左右峰電流值有明顯變化，且峰電流值隨濃度的增大而降低。底物濃度在0.5～8.5μmol／L 時(shí)，氧化峰電流值隨濃度的增大而降低，但濃度大于8.5μmol／L 時(shí)電流反常，而且變化值很小。為避免底物濃度過(guò)小導(dǎo)致電極響應(yīng)不明顯，又不致使底物濃度過(guò)大而導(dǎo)致酶的活性中心被底物全部占據(jù)從而對(duì)抑制劑不敏感，引起檢測(cè)下限升高，選擇最適濃度為8.5μmol／L。

2.4 pH及孵育時(shí)間的優(yōu)化

由圖5（A）可知，當(dāng)pH 值在5.0～7.5時(shí)，響應(yīng)電流逐漸增大，pH＝7.5時(shí)響應(yīng)電流最大，pH 大于7.5時(shí)，響應(yīng)電流反而減小。因此，選擇0.1mol／L pH 7.5的PBS為測(cè)試底液。

由圖5（B）可知：在1～5min，隨著孵育時(shí)間的增加，峰電流不斷下降；5 min后，隨著孵育時(shí)間的增加，峰電流的變化平緩，說(shuō)明峰電流進(jìn)入平臺(tái)期，直至試驗(yàn)結(jié)束，電流值變化不大，說(shuō)明毒死蜱與AChE作用使酶失活已經(jīng)達(dá)到平衡，可以對(duì)酶的抑制效果進(jìn)行檢測(cè)。所以，確定毒死蜱對(duì)AChE 的最佳孵育時(shí)間為5min。

圖4 修飾電極對(duì)氯化乙酰膽堿的循環(huán)伏安響應(yīng)（A）和氯化乙酰膽堿的濃度與峰電流之間的關(guān)系（B）Fig.4 Cyclic voltammetry response diagram of the modified electrode to acetylcholine chloride（A）and The relation between different acetylcholine chloride concentration and peak current（B）

圖5 pH 值（A）和抑制時(shí)間（B）的修飾電流Fig.5 Effect of pH （A）and restricted time（B）on modified electrode

2.5 傳感器對(duì)毒死蜱的電化學(xué)響應(yīng)

隨著毒死蜱的加入，AChE的催化活性被抑制，導(dǎo)致電流下降（圖6A），且電流下降的程度與溶液中的抑制劑毒死蜱的濃度成正比。由電流的抑制率公式[13]：抑制率I%＝（I0－In）／I0（I%為電流抑制率，I0和In分別為抑制前后的峰電流值）處理數(shù)據(jù)得到（圖6B），根據(jù)抑制率和濃度構(gòu)建酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)毒死蜱的抑制率曲線，農(nóng)藥抑制率與濃度在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。在0.71～5.70μmol／L 的范圍內(nèi)抑制率回歸方程為I%＝2.375 8c＋16.918，相關(guān)系數(shù)R2＝0.809 8；在5.70～71.13μmol／L 的范圍內(nèi)抑制率回歸方程為I%＝0.055 3c＋28.682，相關(guān)系數(shù)R2＝0.964 9。檢出限達(dá)0.23μmol／L，說(shuō)明，該傳感器檢測(cè)毒死蜱時(shí)具有較高的靈敏度，可利用毒死蜱對(duì)膽堿酯酶的抑制作用檢測(cè)毒死蜱的濃度。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)試

采用傳感器對(duì)畢節(jié)流倉(cāng)河水進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果（表）表明，回收率在96%～102%，說(shuō)明該傳感器可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖6 修飾電極對(duì)不同濃度毒死蜱（0.71，1.43，2.90，4.27，5.70，14.26，42.68，71.13mmol／L）的循環(huán)伏安響應(yīng)（A）及相對(duì)應(yīng)的抑制曲線（B）Fig.6 Cyclic voltammetry response diagram of modified electrode to Chlorpyrifo with different concentration including 0.71；1.43；2.90；4.27；5.70；14.26；42.68and 71.13mol／L（A）and corresponding inhibition curves（B）

表 水樣中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)（n＝5）Table Detection of Organic phosphorus pesticide in water samples（n＝5）

3 小結(jié)與討論

電化學(xué)傳感器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥開(kāi)辟了電化學(xué)與分子生物學(xué)的新領(lǐng)域，為生命科學(xué)的研究提供一種全新的方法。生物傳感器因其快速、高效、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥方面有著傳統(tǒng)方法不可代替的優(yōu)勢(shì)。將GO－CNTs納米復(fù)合物作為載體構(gòu)建以AChE為催化活性中心的農(nóng)藥殘留檢測(cè)傳感器能更準(zhǔn)確地對(duì)毒死蜱進(jìn)行檢測(cè)，在最優(yōu)條件下，在0.71～71.13μmol／L具有良好的線性關(guān)系，最低檢出限達(dá)到0.23μmol／L，大大提高了傳感器的靈敏度，能對(duì)毒死蜱進(jìn)行快速靈敏的檢測(cè)、前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、可及時(shí)對(duì)市場(chǎng)上含殘留有農(nóng)藥的蔬菜進(jìn)行檢測(cè)，將一部分農(nóng)藥殘留量超標(biāo)的蔬菜控制在交易市場(chǎng)之外，盡量減少對(duì)人們的傷害。其次，這種方法的檢測(cè)費(fèi)用低，可以被廣泛利用，在目前情況下，酶抑制法是蔬菜市場(chǎng)快速測(cè)定蔬菜中毒死蜱農(nóng)藥殘留的一種有效可行的方法。

由于酶?jìng)鞲衅骷夹g(shù)還處在不斷發(fā)展和完善的過(guò)程中，因此，存在一定的不足，還有很多問(wèn)題有待解決。如保持固定化酶的活性、高度專一性、提高傳感器的穩(wěn)定性和使用壽命等問(wèn)題還有待解決。但隨著技術(shù)的不斷成熟，AChE 傳感器將會(huì)成為檢測(cè)毒死蜱殘留最簡(jiǎn)便、有效的方法。

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