陳雅君， 曹貝貝， 徐衛(wèi)松, 程慧芳， 胡 慧

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)試驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

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豬傳染性胃腸炎病毒HN-2012分離株M基因遺傳變異分析及其真核表達(dá)研究

陳雅君1,2， 曹貝貝1， 徐衛(wèi)松1,2, 程慧芳1， 胡 慧1,2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)試驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

以豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)HN-2012株的M基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增了M基因，經(jīng)克隆測(cè)序后，將該基因序列與NCBI中TGEV毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行遺傳變異分析。將M基因亞克隆至真核表達(dá)載體pCAGGS-M-flag中，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用flag標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析。結(jié)果表明，TGEV HN-2012株的M基因與其他毒株間核苷酸的同源性分別為94.8%～99.0%，與中國(guó)其他毒株關(guān)系較遠(yuǎn)。Western blot結(jié)果可見(jiàn)大小約為29.5 kD的目的條帶，表明M基因成功的在293T細(xì)胞中表達(dá)。

TGEV 河南分離株(HN-2012)；M基因；293T細(xì)胞；真核表達(dá)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)引起的以嘔吐、水樣腹瀉為主要臨床特征的高度接觸性腸道傳染病[1,2]。該病對(duì)2周齡以內(nèi)的仔豬致死率高達(dá)100%，不同年齡和品種的豬均易感染此病。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)為冠狀病毒，其基因組結(jié)構(gòu)包括膜蛋白(M)、小膜蛋白(sM) 、纖突蛋白(S)以及核蛋白(N)等基因。其中，M基因全長(zhǎng)2.5×103bp，編碼初級(jí)翻譯產(chǎn)物為262個(gè)氨基酸殘基的轉(zhuǎn)膜蛋白，切掉信號(hào)肽之后轉(zhuǎn)膜為成熟M蛋白，其相對(duì)分子量約為29 kD。M蛋白在病毒囊膜中歷經(jīng)多次跨膜[6]。M蛋白不僅決定了冠狀病毒的裝配位點(diǎn)，還能介導(dǎo)IFN-a和補(bǔ)體依賴性中和抗體的產(chǎn)生。感染TGEV后仔豬的血液和腸道中的高水平的IFN也證實(shí)TGEV M蛋白與PBL細(xì)胞膜之間的相互作用會(huì)誘導(dǎo)IFN-a產(chǎn)生[6]。本試驗(yàn)對(duì)TGEV河南新分離株(HN-2012)的M基因進(jìn)行克隆及序列分析，并將M基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS中，在293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá)，為研究清楚M蛋白分子的結(jié)構(gòu)、功能以及篩選分子診斷試劑及研制新型核酸疫苗提供科學(xué)基礎(chǔ)，也為研究TGEV在河南以及在中國(guó)的遺傳變異、分子流行病學(xué)等奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒細(xì)胞 TGEV HN-2012株由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)試驗(yàn)室分離并保存；改造的真核表達(dá)載體pCAGGS和真核細(xì)胞293T由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所王漢中研究員饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5a由本試驗(yàn)保存提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 Trans 5K DNA Marker、Trans 15K DNA Marker夠自南京百斯凱科技有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；KOD Neo DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；T4 DNA連接酶和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自Promega公司；胎牛血清、DMEM購(gòu)自Gibco公司；蛋白分子量marker為Fermentas公司產(chǎn)品；Western blot用的HRP標(biāo)記的二抗和顯色系統(tǒng)購(gòu)自Pierce公司。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的TGEV M基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度

注：上游引物插入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物插入BglⅡ酶切位點(diǎn)和flag標(biāo)簽序列。

Note： Forward primer includes XhoI restriction site, and reverse primer includes Bgl Ⅱ restriction site and flag-lable sequence.

1.3 TGEVM基因的PCR擴(kuò)增及克隆

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中模版2 μL，上、下游引物各0.5 μL，KOD Neo DNA聚合酶0.5 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO41 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，退火溫度51.4℃，68 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收目的片段，克隆到pGEM-T easy vector，進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 序列測(cè)定及分析

將經(jīng)PCR鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將所得基因序列與GenBank中登錄的不同毒株的TGEV M蛋白基因序列，及由其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析比較。所選序列見(jiàn)表2。

1.5M基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ分別對(duì)pGEM-Teasy-M-flag和pCAGGS載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后，切取酶切產(chǎn)物，用膠回收純化試劑盒分別回收目的片段，再用T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂含Amp的LB平板培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCAGGS-M-flag。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

表2 從NCBI中所選TGEV 基因登錄號(hào)

用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞接種到小的細(xì)胞培養(yǎng)皿(35 mm), 轉(zhuǎn)染前密度達(dá)到80 %左右；接種細(xì)胞18～20 h后可用于轉(zhuǎn)染。具體步驟為：①取出小皿培養(yǎng)的細(xì)胞，更換新鮮的含10 %血清的DMEM培養(yǎng)液；②取2個(gè)無(wú)菌的EP管，標(biāo)記為A1和B1。先向A1管內(nèi)依次加入對(duì)應(yīng)體積的ddH2O、pCAGGS-M-flag質(zhì)粒、CaCl2，輕輕混勻(終體積為100 μL)；B1管內(nèi)加入100 μL的2×HBS溶液；③將管A和管B溶液混合：即將管A內(nèi)混合液慢慢滴加至管B中，一邊滴加管A液體一邊輕彈管B溶液；④混合好后室溫靜置30 min；⑤將室溫靜置了30 min的混合液(A+B)用移液器輕輕混勻后滴加到小皿內(nèi)，放置37 ℃ ，5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；⑥轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的培養(yǎng)液。同時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCAGGS作為陰性對(duì)照。

1.7 Western blot鑒定M基因的表達(dá)情況

收集轉(zhuǎn)染后24 h的293T細(xì)胞，先用PBS洗1～2次，向細(xì)胞中加入100 μL的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min；12 000 r·min-14 ℃離心5 min；取上清液，加入 25 μL的5倍上樣Buffer，沸水中煮 10 min，12 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。利用半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜放入5% BSA中4 ℃封閉過(guò)夜；TBST洗滌3次，每次5 min；加入flag標(biāo)簽抗體 4 ℃過(guò)夜或37 ℃ 1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；加入1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG(HRP標(biāo)記)，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；進(jìn)行HRP顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGEVM基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以TGEV HN-2012株的cDNA為模板，加入上、下游引物，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。在789 bp處獲得了一特異性條帶，與預(yù)期大小相符。

M: Trans 5K DNA Marker;1:TGEV HN-2012 M PCR擴(kuò)增結(jié)果,2:空白對(duì)照。

M: Trans 5K DNA Marker; 1: TGEV HN-2012 M gene of PCR amplification.2: Negative control.

圖1 TGEV HN-2012M的PCR擴(kuò)增

Fig.1 TGEV HN-2012Mgene of PCR amplification

2.2 HN-2012株TGEVM基因的遺傳變異分析

將PCR擴(kuò)增得到的M基因全長(zhǎng)克隆、測(cè)序后，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件MegAlign對(duì)所測(cè)得的基因序列進(jìn)行遺傳變異分析。結(jié)果顯示，TGEV HN-2012株M基因與其它毒株的核苷酸序列同源性為94.8%～99%，與attenuated H株(EU074218.2，China)和H16(FJ755618.2，China)同源性最高，為99.0%。遺傳進(jìn)化分析顯示HN-2012株的M基因和其它毒株在1個(gè)群，而FJ株在另1個(gè)群，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HN-2012毒株獨(dú)立的分出1個(gè)亞群，而同一群的其它毒株在另1個(gè)亞群(圖2)。

2.3 重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag的構(gòu)建

分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ?qū)GEM-Teasy-M-flag進(jìn)行雙酶切，純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-M-flag。對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，目的片段的大小與預(yù)期一致，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 Western blot分析pCAGGS-M-flag在293T細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag的293T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有針對(duì)flag的標(biāo)簽抗體的特異性條帶為29.5 kD；而在轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的293T細(xì)胞中，在這個(gè)位置未檢測(cè)到相應(yīng)的目的條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可成功表達(dá)蛋白(圖4)。

圖2 TGEV HN-2012 M基因核苷酸進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

M: Trans 15k DNA Marker; 1: 重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag雙酶切; 2:陰性對(duì)照。

M: Trans 15k DNA Marker; 1: Recombinant plasmid pCAGGS-M-flag degested by restriction enzyme; 2 Negative control.

圖3 重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag雙酶切結(jié)果

Fig.3 Recombinant plasmid pCAGGS-M-flag doubleenzyme cutting results

M: 預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker；1: 轉(zhuǎn)染pCAGGS-M-flag的293T細(xì)胞; 2: 轉(zhuǎn)染的pCAGGS的293T細(xì)胞。

M: Prestained protein Marker; 1: 293T cells transfected with pCAGGS-M-flag vector;2: 293T cells transfected with pCAGGS vector.

圖4 M重組蛋白Western blot分析結(jié)果

Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein M

3 結(jié)論與討論

豬傳染性胃腸炎是一種嚴(yán)重危害仔豬健康的高度接觸傳染性腸道疾病。目前，調(diào)查研究顯示歐洲國(guó)家豬群血清TGEV陽(yáng)性率可達(dá)100%。中國(guó)部分發(fā)病豬場(chǎng)仔豬的存活率可低至10%，因而該病的防制對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)至關(guān)重要。TGEV包括4種結(jié)構(gòu)蛋白，纖突糖蛋白(S)、 膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和小包膜糖蛋白(E)。M蛋白是一種跨膜蛋白，在病毒裝配、成熟和釋放中起著重要作用。本研究從實(shí)驗(yàn)室分離的TGEV HN-2012毒株中擴(kuò)增出全長(zhǎng)M基因，和其它毒株的M基因進(jìn)行了遺傳變異分析，結(jié)果顯示TGEV HN-2012的M基因與其他毒株間核苷酸的同源性在94.8%以上，證實(shí)M基因具有較高的保守性。這為M基因作為T(mén)GEV分子生物學(xué)診斷侯選基因提供了理論依據(jù)。

TGEVM基因編碼的M蛋白是一種N-端和C-端被糖基化的完整膜蛋白，其羧基端暴露于病毒粒子的表面，是病毒的免疫顯性區(qū)，針對(duì)該區(qū)域的特異性抗體可以有效中和TGEV以及介導(dǎo)受細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體溶解反應(yīng)[7]。M蛋白主要包埋于病毒脂質(zhì)囊膜，主導(dǎo)了病毒顆粒的構(gòu)建[8,9]，決定了病毒粒子的裝配位點(diǎn)、出芽位點(diǎn)以及病毒的成熟，同時(shí)介導(dǎo)IFN-a以及補(bǔ)體依賴性中和抗體的產(chǎn)生[10]。有報(bào)道表明IFN-a的產(chǎn)生依賴于M基因N末端的最后22個(gè)殘基[11,12]。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了含M基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過(guò)免疫印跡的方法證實(shí)M基因在293細(xì)胞中成功表達(dá)。TGEV M蛋白在體外成功表達(dá)，可作為診斷抗原，亦可用其制備抗血清及單克隆抗體，進(jìn)行疾病的快速診斷，也為豬傳染性胃腸炎新型核酸疫苗的研制奠定了理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

Genetic variation analysis and eukaryotic expression ofMgene of porcine transmissible gastroenteritis virus of HN-2012 strain

CHEN Yajun1,2, CAO Beibei1, XU Weisong1,2, CHENG Huifang1, HU Hui1,2

(1.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Zoonotic Food Safety Key Laboratory of Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

A pair of primers were designed according to theMgene of porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) HN-2012 strain, theMgene was amplificated, cloned and sequenced. The sequencedMgene was compared with the otherMgene sequences of TGEV obtained in NCBI, and phylogenetic tree was constructed to analyze the genetic variation. Then the M gene was cloned into the eukaryotic expression vector pCAGGS-M-flag. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells, and tested by western blot using the flag tag antibody. The results showed that the necleotide similarity betweenMgenes of the TGEV HN-2012 strain and other strains was from 94.8% to 99.0%, showing HN-2012 strain differed from all other TGEV isolates, and formed a new separate group. Western blot result showed the M protein was expressed successfully in 293T cells with a 29.5 kD protein.

TGEV HN-2012 strain;Mgene; 293T cells; erkaryotic expression

2015-01-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101796)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(112300410161)

陳雅君(1985-)，女，河南焦作人，碩士研究生，從事動(dòng)物病原學(xué)方面的研究。

胡 慧(1976-)，女，陜西西鄉(xiāng)人，副教授，博士。

1000-2340(2015)04-0472-04

S852.659

A