牛寶珍,杜 民,陳松林

(1.紅河學(xué)院 云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 蒙自 661199;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)是目前已經(jīng)研究的脊椎動(dòng)物基因組最具多態(tài)性區(qū)域,它的編碼產(chǎn)物在獲得性免疫中起著很大的作用[1-2],這些編碼產(chǎn)物結(jié)合抗原肽以及與T細(xì)胞受體(TCR)相互作用從而激發(fā)一個(gè)特定的免疫反應(yīng)[3-4]。已經(jīng)報(bào)道了魚類中 MHCⅠ類和Ⅱ類分子,它們結(jié)合不同的T細(xì)胞而分為兩類MHC基因編碼蛋白[5]。魚類上 MHC基因的研究開始于 Hashimoto等[6]1990年對(duì)鯉魚(Cyprinus carpio)的研究。目前,許多魚類MHC基因已經(jīng)被分離出來,包括鯊魚(Carcharodon carcharias)[7-8]、麗魚(Alticorpus macrocleithrum)[9]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[10]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[11]、鯉魚[12]等。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus),俗稱牛舌、鰨目、鰨米等,分布于中國(guó)黃渤海,在東海、南海、也有分布[13]。在鰨類中半滑舌鰨為個(gè)體偏大種類,因其味道優(yōu)美,營(yíng)養(yǎng)豐富受消費(fèi)者喜愛,已經(jīng)成為中國(guó)新開發(fā)的養(yǎng)殖品種[14];半滑舌鰨的MHCⅠ類基因[15]、β2m基因[16]、Ⅱ類A和Ⅱ類 B[17]已經(jīng)被確定出來。每個(gè) MHCⅡ類 B基因編碼區(qū)多態(tài)性最高片段是其第二外顯子編碼的β1結(jié)構(gòu)域[18];β1結(jié)構(gòu)域和MHCⅡ類A基因編碼的α1結(jié)構(gòu)域一起組成了MHCⅡ類分子的多肽結(jié)合槽,從而能夠錨定外源多肽[19]。MHC基因的高度變異使得在一個(gè)群體中產(chǎn)生了大量等位基因,每個(gè)等位基因或多或少的具有結(jié)合和呈遞不同類型多肽的能力[5]。因此,一個(gè)有機(jī)體對(duì)特定抗原的反應(yīng)可能受到 MHC基因單倍型的影響。魚類中,大西洋鮭(Salmo salar)MHCⅡ類基因多態(tài)性已經(jīng)被研究[20-21],Du等[22]對(duì)牙鲆(Paralichthys olivaceus)7個(gè)家系中的 MHCⅡ類基因多態(tài)性進(jìn)行研究并且對(duì)大菱鲆的MHC的抗遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)與MHCⅡ類基因的特定基因型的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了相關(guān)研 究[23]。

本實(shí)驗(yàn)室于2008年采用雄性野生群體與雌性養(yǎng)殖群體生產(chǎn)出18個(gè)半滑舌鰨家系[24]。本研究目的是檢測(cè)10個(gè)半滑舌鰨家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多態(tài)性水平、MHCⅡ類B位點(diǎn)數(shù)目以及平衡選擇的作用,為半滑舌鰨的分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

2008年 9月,在山東省萊州明波水產(chǎn)養(yǎng)殖公司建立半滑舌鰨全同胞家系和半同胞家系,親本來源、家系建立飼養(yǎng)情況參照陳松林等[24]的報(bào)道。

1.2 取樣及DNA提取

從10個(gè)普通半滑舌鰨家系中各隨機(jī)選取5尾魚,每尾體質(zhì)量7～8 g,利用MS222(1g/kg)麻醉后剪取尾鰭保存在無水乙醇中。利用酚-氯仿方法[25],從尾鰭中提取半滑舌鰨總的 DNA。用 1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,在凝膠成像儀上進(jìn)行 DNA濃度檢測(cè),并將其濃度均調(diào)至為100 ng/μL,–20℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

根據(jù) Xu等[15]報(bào)道的 cDNA序列設(shè)計(jì)的特定引物: hMPN12 (5′-CTCTCTTCTCTTCCTCCTCAC-3′)和 hMPC-12 (5′-ACACTCACCTGATTTAGCCA-3′),擴(kuò)增半滑舌鰨 MHCⅡB第二外顯子序列,上游引物和下游引物分別位于第一外顯子和第二外顯子的末端。

25 μL的PCR反應(yīng)混合物包含1 μL的半滑舌鰨基因組DNA模板、2.5 μL的10×TaqDNA多聚酶緩沖液(TransGen Biotech)、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L的特定引物(正向引物和反向引物)、1 UTaq多聚酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min、然后30個(gè)循環(huán)(94℃變性40 s、53℃退火40 s、72℃延伸50 s),最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在Peltier 熱循環(huán)儀(PTC-200)上完成。利用凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Imager Gel Doc XR Biorad美國(guó))檢測(cè)確認(rèn)擴(kuò)增片段。

1.4 克隆和DNA序列測(cè)定

切割預(yù)期大小PCR產(chǎn)物的膠并且利用QIAEXII凝膠回收試劑盒(QIAGEN)進(jìn)行回收純化。根據(jù)操作說明書將純化產(chǎn)物連接到 PBS-T載體后,轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。利用M13的正向和反向引物進(jìn)行 PCR篩選陽性克隆;每個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物選5個(gè)克隆在ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀上用M13+/–引物測(cè)序。

1.5 基因型、序列分析和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析

利用 DNAMAN軟件對(duì)所有的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。同義替換(dS)與非同義替換(dN)的比率用MEGA4.0軟件[26]中修正 Nei和 Gojobori的成對(duì)-距離方法[27]進(jìn)行估算。用 DAMBE軟件和 DnaSP5.0軟件用來分析序列核苷酸值[28]。用SPSS13.0軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)Davies等[29]報(bào)道的規(guī)則命名新發(fā)現(xiàn)的等位基因[30-31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 10個(gè)半滑舌鰨家系中MHC II第二外顯子序列的多態(tài)性

本研究中從10個(gè)家系共選取50個(gè)體,每個(gè)體選取5個(gè)克隆進(jìn)行克隆及測(cè)序,得到250個(gè)序列。根據(jù)已發(fā)表的半滑舌鰨MHCⅡB cDNA序列[17]和內(nèi)含子-外顯子的GT-AG剪接規(guī)則,共得到397 bp片段,包含35 bp的第一外顯子、整個(gè)第一內(nèi)含子(84 bp,包含一個(gè)12bp的CA重復(fù)序列)以及完整的第二外顯子序列(270 bp)。第二外顯子編碼MHCⅡB基因的β1結(jié)構(gòu)域。有些序列僅發(fā)現(xiàn)一次,推測(cè)可能是由于 PCR錯(cuò)誤所致,如錯(cuò)配、Taq DNA 聚合酶錯(cuò)誤等。另外大腸桿菌異源雙鏈修復(fù)錯(cuò)誤也是可能原因[32-33]。刪除這些序列后得到60個(gè)不同的序列,有32個(gè)序列與本實(shí)驗(yàn)室已獲得序列相同[34],本研究中新發(fā)現(xiàn)28個(gè),代表 28個(gè)不同的等位基因,并遞交到 GeneBank上(表 1)。

10個(gè)家系中每個(gè)體選取 5個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,只發(fā)現(xiàn)1個(gè)等位基因的有2個(gè)個(gè)體,發(fā)現(xiàn)2個(gè)等位基因的有6個(gè)體,發(fā)現(xiàn)3個(gè)等位基因的有21個(gè)體,發(fā)現(xiàn)4個(gè)等位基因的有15個(gè)體,發(fā)現(xiàn)5個(gè)等位基因的有6個(gè)體。表 2 顯示每個(gè)體等位基因數(shù)目及對(duì)應(yīng)個(gè)體的數(shù)目,在10個(gè)半滑舌鰨家系中MHCⅡB基因上,只有 4% 的檢測(cè)個(gè)體是純合體(所有的家系都是雜合的),亦即在4#和19#家系中各出現(xiàn)一個(gè)純合體(所測(cè)的序列完全相同)。各個(gè)家系等位基因的頻率在每個(gè)家系中的分布不具有顯著性。1#、3#、4#、6#、16#、19#、24#、28#、33#、34#家系中出現(xiàn)的序列和全部序列相似性分別為 89.89%、94.26%、88.24%、92.35%、94.67%、93.7%、90.37%、90.16%、93.22%、88.84%和89.36%。

在得到的 60個(gè) MHCⅡB基因第二外顯子序列中沒有發(fā)現(xiàn)插入、缺失和終止密碼子,表明這些序列來自于半滑舌鰨基因組的功能位點(diǎn)。在60個(gè)序列中,每個(gè)位點(diǎn)核苷酸多態(tài)性值Pi (p)和Theta-W值分別是0.14008和0.08975;270個(gè)核苷酸位點(diǎn)中有113個(gè)變異位點(diǎn): 其中91個(gè)是簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。單倍型多樣性值(H)和核苷酸差異平均數(shù)目(k)分別為1和37.823。

表1 等位基因和Genbank登錄號(hào)Tab.1 Alleles and their GenBank accession number

表2 10個(gè)半滑舌鰨家系中每尾魚的Scma-DAB等位基因數(shù)目和5種等位基因情況下的個(gè)體數(shù)目Tab.2 The allele number per individual in 10 half-smooth tongue sole families and the individual number in five different allele models

2.2 半滑舌鰨MHCⅡB 基因選擇作用

在半滑舌鰨MHCⅡB基因第二外顯子多肽結(jié)合區(qū)(PBR),23個(gè)氨基酸位點(diǎn)中有20(86.96%)個(gè)是變異位點(diǎn),并且在69個(gè)核苷酸中有40(57.97%)個(gè)是變異位點(diǎn)。在60個(gè)序列的多肽結(jié)合區(qū)中,非同義替換(dN)和同義替換(dS)的值分別是0.285和0.127,非同義替換(dN)與同義替換(dS)的比值為 2.2441;而在非多肽結(jié)合區(qū)中,非同義替換(dN)和同義替換(dS)的值分別為 0.095和 0.130,表明在多肽結(jié)合區(qū)經(jīng)歷著正向的達(dá)爾文選擇(表3)。表3列出了每個(gè)家系代表序列在多肽結(jié)合區(qū)的非同義替換和同義替換的比值,只有28#家系個(gè)體中的多肽結(jié)合區(qū)的非同義替換與同義替換的比率不具有顯著性外,另外的 9個(gè)家系中的多肽結(jié)合區(qū)的非同義替換顯著高于同義替換,表明在這些家系中個(gè)體MHCⅡB基因多肽結(jié)合區(qū)的堿基經(jīng)歷達(dá)爾文選擇。半滑舌鰨多肽結(jié)合區(qū)推斷和鑒定是根據(jù)Brown等[19]對(duì)人類HLA-DRB 基因相應(yīng)區(qū)域的限定。

3 討論

MHCⅡB 基因最多態(tài)性的區(qū)域是由β鏈第二外顯子非同義替換造成的。在本研究中,作者利用PCR和直接測(cè)序方法揭示了 10個(gè)半滑舌鰨家系中 MHC classⅡB 基因第二外顯子基因多態(tài)性和選擇作用;也有其他魚類的相關(guān)報(bào)道: Xu 等[35]在 12個(gè)牙鲆家系60個(gè)體中發(fā)現(xiàn)76個(gè)等位基因;Rakus等[36]在9個(gè)鯉魚品系中發(fā)現(xiàn) 7個(gè)不同的 MHC classⅡB 基因單倍型并且這些單倍型的頻率也不相同;Stet等[37]在84個(gè)大西洋鮭個(gè)體上發(fā)現(xiàn) 7個(gè) Sasa-DAA和 7個(gè)Sasa-DAB等位基因;Langefors等[38]通過直接測(cè)序在25個(gè)波羅的海大西洋鮭的22個(gè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)單倍型中確認(rèn)17個(gè)MHC classⅡB基因第二外顯子等位基因。作者對(duì)50個(gè)半滑舌鰨家系個(gè)體中發(fā)現(xiàn)60個(gè)MHCⅡB等位基因表明半滑舌鰨遺傳多樣性較高。

表3 10個(gè)半滑舌鰨家系中MHCⅡB 基因第二外顯子中多肽結(jié)合區(qū)(PBR)、非多肽結(jié)合區(qū)(non-PBR)的同義替代率(dS)和非同義替代率的比值及顯著性分析Tab.3 Synonymous(dS)and non-synonymous(dN)substitution rates and significant levels in the putative peptides binding region(PBR)and non-peptides binding region(non-PBR)among half-smooth tongue sole alleles

本研究半滑舌鰨個(gè)體中,有6個(gè)個(gè)體出現(xiàn)5個(gè)不同等位基因,從而推測(cè)半滑舌鰨的 MHCⅡB基因至少存在3個(gè)位點(diǎn)或者拷貝,這與Xu等[17]的研究結(jié)果相一致。相似的報(bào)道也在其他魚類中發(fā)現(xiàn): 李華等[39]利用PCR-SSCP和直接測(cè)序的方法對(duì)豬SLA-DQB基因第二外顯子進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)有的個(gè)體中存在 5個(gè)不同等位基因現(xiàn)象,從而推斷在有些品種豬中具有3個(gè)DQA基因拷貝或位點(diǎn);張玉喜等[40]通過直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)84個(gè)牙鲆個(gè)體中有59個(gè)體表現(xiàn)2種或2種以上不同序列,并且其中有一個(gè)個(gè)體中發(fā)現(xiàn)有 5種不同的序列,推測(cè)這些個(gè)體具有較高的雜合度或者至少存在3個(gè)不同的基因位點(diǎn)。本文每個(gè)體僅測(cè)了5個(gè)克隆,是否增加克隆數(shù)就可以有發(fā)現(xiàn)更多的等位基因呢？這在以后的類似的工作中要作進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)于MHCⅡB基因第二外顯子多態(tài)性的假說有:雜種優(yōu)勢(shì)、超顯性選擇、頻率依賴的選擇或平衡選擇[41]。目前許多相關(guān)研究支持平衡選擇假說[42-43],平衡選擇經(jīng)常通過在多肽結(jié)合區(qū)的非同義替換率(dN)與同義替換(dS)的比率來進(jìn)行推斷。如果dN/dS的比率顯著高于1,則表明正向選擇在起作用。在本研究的10個(gè)半滑舌鰨家系MHCⅡB序列中,除28#家系中的 MHCⅡB基因序列多肽結(jié)合區(qū)(PBR)的非同義替換比率與同義替換比率不具有顯著性外(Z檢驗(yàn)的P=0.054＞0.05),另外9個(gè)家系中MHCⅡB基因序列在多肽結(jié)合區(qū)(PBR)的非同義替換要顯著高于同義替換(表3)。據(jù)此認(rèn)為在半滑舌鰨MHCⅡB基因進(jìn)化過程中受到正向選擇的影響,從而產(chǎn)生如此多的等位基因。作者發(fā)現(xiàn)在半滑舌鰨MHCⅡB基因的多肽結(jié)合區(qū)上非同義替換高于同義替換,推測(cè)半滑舌鰨MHCⅡB基因可能與人類 HLA-DRB基因具有相似的功能[19]。各等位基因在個(gè)體及家系中出現(xiàn)的頻率也不同,可能是由于個(gè)體對(duì)環(huán)境的選擇壓力不同而造成的[43]。本研究發(fā)現(xiàn)的 60個(gè)等位基因中,有 32個(gè)等位基因所在實(shí)驗(yàn)室已有報(bào)道[34],另外28個(gè)等位基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn),表明等位基因也具有個(gè)體或者群體差異。

總之,在10個(gè)家系50個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了60個(gè)序列,表明在半滑舌鰨的MHCⅡB基因第二外顯子具有高度多態(tài)性,為下一步在半滑舌鰨家系間 MHCⅡB等位基因與抗/易感特定病原間的相關(guān)性研究提供基礎(chǔ)資料。

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