汪招雄，歐陽金旭，楊玉瑩，張平英，程太平，盧文婷

（1.長江大學動物科學學院，湖北荊州434025；2.湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，湖北荊州434100）

禽流感是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種急性傳染病，病毒毒力較強時雞群可表現(xiàn)嚴重的全身性、出血性、敗血性癥狀，病死率較高；毒力弱時雞群表現(xiàn)為輕度的呼吸道或消化道癥狀，病死率較低。禽流感病毒不僅威脅禽類的健康，也威脅人類健康，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。世界動物衛(wèi)生組織（WHO）將禽流感列為必須報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。在我國，高致病性禽流感以H5N1亞型為代表，低致病性禽流感以H9N2亞型為主。

1994年我國首次從廣東省雞場中分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒，此后，該亞型禽流感病毒迅速向臨近省份蔓延。隨著H9N2亞型滅活疫苗在我國廣泛應用，該病在一定程度上得到有效的控制。然而，在部分地區(qū)，由于防疫意識不高、免疫程序不合理，該病毒在部分蛋雞場仍然時有發(fā)生，導致雞群出現(xiàn)呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率下降，雞蛋品質嚴重下降。本研究從湖北省不同地區(qū)隨機采集不同日齡蛋雞樣本，監(jiān)測H9N2亞型禽流感疫苗免疫效果，以期制定符合當?shù)仉u群的防控H9N2亞型禽流感免疫程序，減少疫情發(fā)生幾率。

1 材料與方法

1.1 材料

H9N2亞型禽流感病毒血凝抑制試驗標準抗原（生產(chǎn)批號：201305）、陽性血清，中國哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司產(chǎn)品；8.5g／L生理鹽水作為稀釋液，紅細胞保存液（PBS液），38g／L檸檬酸鈉抗凝劑。

1.2 方法

1.2.1 血液血液采集及血清制備 對湖北不同地區(qū)（公安、京山、沙洋、天門、浠水、仙桃、襄陽區(qū)、孝感、應城、棗陽）規(guī)模蛋雞場的雞隨機采血，每只翅下靜脈采血2mL，共采集血樣1 631份。采集血樣靜置1h，待血清析出后，3 000r／min離心5min，取上層血清待檢。

1.2.2 10mL／L紅細胞懸液制備 用一次性注射器隨機采取健康非免疫公雞血液，放入加有抗凝劑的離心管中，抗凝劑與全血的比例約為1∶2左右，迅速混勻。然后放入離心機中以3 000r／min離心5 min，吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，再次在離心管中加生理鹽水，慢慢混合均勻，3 000 r／min離心5min，棄去上清液，按照上述方法反復操作4次～5次，直到上清液澄清透明，最后一次離心后的紅細胞，棄去上清液，即為紅細胞泥。放入4.0℃冰箱中可保存2d～3d。每次抗體檢測時吸取0.1mL紅細胞泥，加入9.9mL的生理鹽水，即為10mL／L紅細胞懸液。注意紅細胞懸液要現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前需要觀察紅細胞是否變質。

1.2.3 4單位抗原配制 取出凍干的濃縮抗原，加入2mL～3mL生理鹽水稀釋融化后，測其抗原效價，能夠完全引起血凝的病毒最高稀釋度視作抗原的效價，此稀釋度為1個HA單位抗原，以此稀釋度配制4個HA單位抗原。

1.2.4 待檢樣品測定 根據(jù)血凝抑制試驗的方法及操作規(guī)范對血清樣品進行檢測，設置陰性和陽性對照。

2 結果

2.1 不同月份蛋雞場樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體效價分析

按照不同月份，分別對2013年6月至12月蛋雞血清1 631份進行H9N2亞型禽流感病毒抗體檢測，抗體滴度檢測結果見表1和表2。

由表1可以看到，所有樣本中，10月份H9N2亞型禽流感平均抗體滴度最高，達到9.55log2，8月份平均抗體滴度最低，為8.71log2。6、7、9、11、12月份平均抗體滴度介于兩者之間。

從表1、表2中可以看出各個月份血樣中禽流感病毒H9亞型抗體合格率（≥6）最低的是8月份，為88.1%，9月稍高，為94.3%，抗體滴度最高的是7月份，為100.0%，其他各月平均抗體滴度介于8月和7月之間；優(yōu)秀率（≧9）最低的是9月份，為73.8%，最高的是10月份，為90.7%，其他各月介于這二者之間。其中8月份和9月份的優(yōu)秀率要明顯低于其他幾個月。

表1 規(guī)模化蛋雞場不同月份H9N2亞型禽流感病毒抗體效價Table 1 The antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different months

2.2 不同地區(qū)蛋雞場樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體效價分析

對10個不同地區(qū)樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體抗體滴度檢測結果見表3和表4。

表2 規(guī)?；半u場不同月份H9N2亞型亞型禽流感抗體效價合格率和優(yōu)秀率Table 2 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different months

表3 規(guī)模化蛋雞場不同地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒抗體效價Table 3 The antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different areas

根據(jù)表3顯示，湖北省不同地區(qū)樣本中，抗體滴度平均值最低的來源于沙洋，H9N2亞型禽流感病毒抗體效價平均為7.94log2，抗體整齊度差，差值相差較大；抗體滴度最高的是來源于浠水的蛋雞樣本，H9N2亞型禽流感病毒抗體效價平均為9.88log2，其他各個地區(qū)蛋雞血樣的抗體效價平均值介于這二者之間。除了沙洋蛋雞樣本外，其他各個地區(qū)的H9N2亞型禽流感病毒抗體效價平均滴度值均在9.00log2以上。

表4 規(guī)?；半u場不同地區(qū)H9N2亞型禽流感抗體效價合格率和優(yōu)秀率Table 4 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different areas

從表4中可以看出各個地區(qū)采集來的血液樣本中，來源于沙洋血樣中H9N2亞型禽流感病毒抗體合格率（≥6）最低，為80.0%，合格率最高的是來源于浠水的血樣，為100.0%，其他各個地區(qū)的血液樣本的合格率介于這兩者之間。而來源于京山，沙洋，應城和棗陽的樣本中H9N2亞型禽流感病毒抗體優(yōu)秀率（≥9）均低于80.0%。

2.3 不同日齡蛋雞H9N2亞型禽流感病毒抗體效價分析

對不同日齡蛋雞樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體效價分析結果見表5、表6。

由表5可以看到，不同日齡蛋雞血液樣本中，日齡小于等于105d的樣本H9N2亞型禽流感抗平均滴度值最低，為9.08log2，隨著日齡的不斷上長，樣本的H9N2亞型禽流感抗平均滴度值不斷上升。

從表6中可以看到不同日齡蛋雞的樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體合格率均在90.0%以上，而在蛋雞日齡小于等于105d時的這段時間，H9N2亞型禽流感病毒抗體優(yōu)秀率為74.6%，明顯低于其他日齡蛋雞的血液樣本，而在蛋雞日齡在105d和300d之間，H9N2亞型禽流感病毒抗體滴度大于等于9的比例不超過81.2%。

表5 不同日齡蛋雞H9N2亞型禽流感病毒抗體效價Table 5 The antibody titers of H9N2subtype AIV from different day age layers

表6 不同日齡蛋雞H9N2亞型禽流感病毒抗體效價合格率和優(yōu)秀率Table 6 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from different day age layers

3 討論

歷時7個月對湖北省規(guī)?；半u場雞群禽流感病毒滅活疫苗免疫抗體水平進行了檢測，結果顯示，在不同區(qū)域，整體上H9N2亞型禽流感疫苗的免疫效果良好，基本可以保護蛋雞群免受同型病毒的感染。該免疫效果與其免疫時所用的單價苗及接種時間的合理選擇有著必不可分的聯(lián)系。因為單價苗的純度較高，而且減少了其他疫苗的干擾，使得機體能夠產(chǎn)生大量的抗體，同時合理的接種時間也有效的維持了高抗體的時長。

但是檢測結果還顯示，相較于其他幾個月檢測樣本，8月份和9月份樣本平均抗體效價均偏低，原因和可能和天氣炎熱有關系。一方面天氣炎熱會引起雞體產(chǎn)生較強的應激反應，影響疫苗免疫效果，另一方面天氣炎熱季節(jié)會造成部分養(yǎng)殖企業(yè)減低疫苗密度、延長H9N2亞型禽流感疫苗免疫時間。因此，養(yǎng)殖企業(yè)要在夏季做好降溫措施，盡量降低蛋雞群機體的免疫應激反應，同時保證雞群對H9N2亞型禽流感合理的免疫密度顯得尤為重要。

在不同地區(qū)，蛋雞在接種H9N2亞型禽流感疫苗后免疫效果存在一定的差異，導致該現(xiàn)象的原因可能與各地的免疫程序和選擇的疫苗有很大的關系。由于各個地方蛋雞場養(yǎng)殖習慣不一樣，養(yǎng)殖水平存在一定的差異，免疫程序、免疫途徑、免疫劑量和所免疫的疫苗也存在差異。因此，建議養(yǎng)殖者根據(jù)最近幾年病原流行的變化調整免疫程序，及時進行抗體監(jiān)測，提高這些地區(qū)雞群康H9N2亞型禽流感病毒抗體水平。

對不同日齡蛋雞的樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體進行分析顯示，加強免疫能夠明顯提高免疫效果。但是在蛋雞日齡在105～200之間，部分雞群抗體滴度值小于4log2，并且存在抗體滴度離散度大，極差大的特點，這提示在雞群進入產(chǎn)蛋后部分雞場免疫仍存在免疫不均、免疫程序不合理的漏洞，值得引起警示。在蛋雞日齡在105d和300d之間，H9N2亞型禽流感病毒抗體滴度大于等于9的比例不超過81.2%，還存在較大的提升空間。

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