吳 強，何生虎＊，劉維華，余永濤，雷元元，羅瑞明

（1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川750021；2.寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川750021）

四環(huán)素類抗生素是發(fā)現(xiàn)于20世紀40年代的一類廣譜抗生素，50年代開始應用于幼兒和孕婦以外的臨床［1-2］；獸醫(yī)臨床上常用的有四環(huán)素、土霉素和金霉素等，它們對革蘭陽性菌、陰性菌、螺旋體、支原體、衣原體、原蟲等均可產(chǎn)生抑制作用，故又稱為廣譜抗生素［3-4］。在養(yǎng)殖業(yè)上，四環(huán)素類藥物在促進畜禽生長、提高飼料報酬、疾病防治等方面發(fā)揮著重要作用［5-6］。由于該類藥物的不合理使用、濫用，對人類健康造成影響［7-9］。首先，四環(huán)素超標可對人體腎臟、肝臟造成損傷。其次，由于四環(huán)素為廣譜抗生素，可對多種細菌有效，因此，四環(huán)素殘留可以殺死人體腸胃內(nèi)正常的菌群，造成腸胃功能失調(diào)，引起腹瀉等癥狀。最后，四環(huán)素會導致骨骼生長停滯。因此，對于四環(huán)素的使用必須非常謹慎與嚴格，對使用四環(huán)素的家畜必須要嚴格遵循國家獸藥典中規(guī)定的休藥期，在現(xiàn)行的獸藥典中牛、羊四環(huán)素的休藥期為8d。

由于鹽酸四環(huán)素高度的抑菌作用，在牛羊養(yǎng)殖中被廣泛使用。本文就鹽酸四環(huán)素注射液在灘羊體內(nèi)的消除規(guī)律進行研究，并預測其在灘羊體內(nèi)的休藥期。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料 鹽酸四環(huán)素標準品，純度大于96%，為Dr.Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；鹽酸四環(huán)素注射液為成都新亨藥業(yè)公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為美國Fisher公司產(chǎn)品；檸檬酸、乙二銨四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉為分析純；HLB固相萃取柱（3mL／60mg）為美國 Waters公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器設備 Agilent 1100高效液相色譜儀、AE-205電子天平為 Mettler Toledo公司產(chǎn)品；CT15RT高速冷凍離心機為日立公司產(chǎn)品；Organomation Associates氮吹儀為美國Organomation公司產(chǎn)品；MS1旋渦合器為IKA公司產(chǎn)品；PL-202L電子天平為美國Mettler Toledo公司產(chǎn)品；FE20酸度計為美國Mettler Toledo公司產(chǎn)品；固相萃取裝置為上海安普科學儀器公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗用動物 健康寧夏灘羊42只，體重25 kg～30kg，雌雄各半，喂飼不添加任何抗菌藥物的全價飼料。試驗前后各組詞養(yǎng)條件相同，自由飲水［10］。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組 42只試驗羊隨機分組，每組7只，空白1只，試驗6只，對所有羊稱重、記錄［11］。

1.2.2 試驗動物給藥及樣品采集 試驗組受試羊與空白對照羊均采用一次性注射器按照10mg／kg體重分別頸靜脈注射鹽酸四環(huán)素與生理鹽水，每天早晚各1次，自由飲水，連續(xù)給藥3d；分別在羊停藥后的0、3、6、9、12、5d，隨機于每個檢測點選擇6頭試驗羊進行屠宰。宰殺之前稱重，試驗羊死亡后對其進行解剖，快速取其肌肉（300g～500g）、肝臟（400g～500g）、雙腎各取一半（縱切）。采集的樣本不作任何洗滌或處理，立即做好標記、包裝，保存于-20℃冰箱，待測。

1.2.3 樣品的處理與檢測 對所采集的所有組織進行勻漿處理［12］，稱取勻漿后的樣品5g置于50mL聚丙烯離心管中，分別用 20、20、10mL 0.1mol／L EDTA-Mcllvainc緩沖溶液水域超聲提取3次，每次漩渦混合1min，超聲提取10min，3 000r／min離心5min（溫度低于15℃），合并上清液（體積不能超過50mL），并定容至50mL，混勻，5 000r／min離心10min（溫度低于15℃），用快速濾紙過濾，然后待凈化。準確吸取10mL提取液（相當于1g樣品），以1滴／s的速度過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5mL水和5mL甲醇＋水淋洗，棄去全部流出液。2.0ku以下減壓抽干5min，最后用10mL甲醇＋乙酸乙酯洗脫。將洗脫液氮吹濃縮至干（溫度低于40℃），0.5mL甲醇＋三氟乙酸水溶液溶解殘渣，過0.45μm濾膜，供高效液相色譜儀測定。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：ZOR BAX Eclipse XDB-C18，4.6mm×250mm，粒徑5μm；流動相：乙腈-甲醇-10mmol／L三氟乙酸水溶液，采用梯度洗脫，流動相比例見表1。流速：1.5mL／min；檢測波長：270nm；柱溫：30℃，進樣量：100μL，自動進樣器進樣。

表1 液相色譜流動相洗脫梯度Table 1 The mobile phase elution gradient of high performance liquid chromatography

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測結(jié)果

本試驗采用國家標準GB／T21317—2007（動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜法與高效液相色譜法）［12］中高效液相色譜法對樣品進行檢測，四環(huán)素的出峰時間在8.2min左右，峰形良好，樣品檢測色譜圖見圖1。

由檢測結(jié)果得知，在羊組織中腎臟藥物濃度最高，肝臟次之，肌肉最少；0d時藥物在灘羊體內(nèi)藥物濃度最高，隨著時間的推移，藥物濃度逐漸降低，0d～3d時，3種組織中藥物濃度降低幅度較大，3d～6 d時，腎臟與肝臟中的藥物濃度下降幅度趨較小，而肌肉中的濃度下降幅度基本不變，6d～9d時，肝臟與腎臟濃度下降幅度再次變大，停藥9d后肌肉組織中四環(huán)素的平均含量為0.078 43mg／kg已低于限量標準（0.1mg／kg），肝臟組織中四環(huán)素的平均含量為 0.199 85mg／kg，已低于限量標準（0.3 mg／kg），腎臟組織中四環(huán)素的平均含量為0.560 47 mg／kg，已低于限量標準（0.6mg／kg）；在12d后，肝臟及腎臟組織中藥物濃度均低于250μg／kg，肌肉藥物濃度降低至50μg／kg。以時間為橫坐標藥，樣品中藥物物濃度為縱坐標繪制藥物濃度變化曲線（圖2）。

圖1 樣品檢測色譜圖Fig.1 The chromatogram of tested samples

2.2 休藥期的測定

將所檢測的結(jié)果輸入WT1.4休藥期軟件（由中國飼料工業(yè)協(xié)會信息中心與北京瑞先農(nóng)科技發(fā)展有限公司聯(lián)合研發(fā)）對四環(huán)素在肌肉、肝臟、腎臟各組織中的休藥期進行預測，結(jié)果表明，以95%耐受限為指標對四環(huán)素在灘羊肌肉組織中休藥期的預測，確定其休藥期為9.7d（圖3）。以95%耐受限為指標對四環(huán)素在肝臟組織中休藥期的預測，確定其休藥期為10.6d。以95%耐受限為指標對四環(huán)素在腎臟組織中休藥期的預測，確定其休藥期12d（圖4）。綜上所述，為了避免四環(huán)素在羊體內(nèi)的殘留對人類健康造成危害，以本試驗為基礎，靜脈注射鹽酸四環(huán)素給藥后推薦的休藥期應為12d（圖5）。

圖3 以95%耐受限為指標灘羊肌肉中休藥期預測Fig.3 Plot of withdrawal time calculation for muscle of Tan-sheep at the time when the one-sided 95%upper tolerance limit was blow the MRL

圖4 以95%耐受限為指標灘羊肝臟組織中休藥期的評估Fig.4 Plot of withdrawal time calculation for liver of Tan-sheep at the time when the one-sided 95%upper tolerance limit was blow the MRL

圖5 以95%耐受限為指標灘羊腎臟組織中休藥期的評估Fig.5 Plot of withdrawal time calculation for kidney of Tan-sheep at the time when the one-sided 95%upper tolerance limit was blow the MRL

3 討論

最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）是指對食品動物用藥后產(chǎn)生的允許存在于食品表面或內(nèi)部的該獸藥殘留的最高量，對于四環(huán)素在動物體內(nèi)的殘留限量，我國有嚴格的規(guī)定，農(nóng)業(yè)部頒布的235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中對四環(huán)素在食品動物中的最高限量為肌肉100μg／kg，肝臟300μg／kg，腎臟600μg／kg，這一標準與歐盟對四環(huán)素殘留最高限量一致。

四環(huán)素類藥物中，以土霉素與多西環(huán)素在動物體內(nèi)消除規(guī)律研究較多，并且主要以水生動物［5-6］和豬［10，13］為研究對象，在牛、羊方面很少查閱到有關于鹽酸四環(huán)素消除規(guī)律研究的文獻，因此本試驗以灘羊為試驗動物，研究鹽酸四環(huán)素在灘羊機體內(nèi)的消除規(guī)律并預測休藥期。

目前，對四環(huán)素類抗生素殘留的檢測方法有多種，即薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法［14］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［15］等，由于本試驗所測樣品量較大，因此本文選擇精確度較高且性價比最合理的高效液相色譜法，參照國家標準GB／T 21317-2007對樣品進行處理與檢測。結(jié)合檢測結(jié)果，以灘羊肌肉、肝臟、腎臟中藥物濃度為標準，通過WT1.4軟件對鹽酸四環(huán)素的休藥期進行評估，在95%耐受限為指標，肌肉、肝臟、腎臟的 WT分別為9.7、10.6、12d。我國獸藥典中明確規(guī)定鹽酸四環(huán)素在所有羊體內(nèi)的休藥期為8d。但由于物種的不同，動物個體差異，藥劑劑型不同，藥物在動物體內(nèi)的代謝快慢存在差異，另外，由于不同品種羊在不同的生長環(huán)境中對藥物的代謝也有影響。因此，為了防止四環(huán)素殘留而對人體造成危害，以本試驗以灘羊為試驗動物，建議鹽酸四環(huán)素在灘羊的休藥期為12d。

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