樊江斌，吳正偉，劉國鋒，王 敦

西北農(nóng)林科技大學植保資源與害蟲治理教育部重點實驗室,陜西楊凌 712100

一種增強蘋果蠹蛾顆粒體病毒田間防效方法的建立

樊江斌，吳正偉，劉國鋒，王 敦?

西北農(nóng)林科技大學植保資源與害蟲治理教育部重點實驗室,陜西楊凌 712100

【背景】蘋果蠹蛾是危害蘋果和梨等薔薇科果實的世界性重要蛀果害蟲之一，目前已侵入我國新疆、甘肅、黑龍江、寧夏、內(nèi)蒙古、吉林、遼寧等7省市，正在向蘋果主產(chǎn)區(qū)擴散，嚴重威脅我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。歐美國家的田間應用證明，CypoGV是防治蘋果蠹蛾效果最佳的生防制劑。研究開發(fā)本土CypoGV商業(yè)化制劑，對保證我國蘋果業(yè)健康發(fā)展有重大意義?！痉椒ā坑檬覂?nèi)和田間生測方法，在半人工飼料中添加被紫外線處理過的氧化鐵和CypoGV-ZY混合懸液，其中氧化鐵的添加濃度分別為3、5、7、10、12 mg·mL－1，并完成其對蘋果蠹蛾初孵幼蟲的生物測定。【結果】在病毒懸液中添加7 mg·mL－1的氧化鐵能顯著提高CypoGV在田間的活性和持久性，與未添加氧化鐵處理相比較，初孵幼蟲死亡率分別提高了53.88%和96.64%?！窘Y論與意義】添加低劑量氧化鐵，顯著增強了CypoGV對田間強日光、強紫外線的適應性，提高了該病毒在田間的活性和持久性，說明氧化鐵可作為商業(yè)化CypoGV制劑的助劑，提高田間CypoGV對蘋果蠹蛾防治效果。本研究為我國CypoGV制劑生產(chǎn)過程中添加助劑提供了依據(jù)。

氧化鐵；UV；生物測定；存活率；增效劑

蘋果蠹蛾Cydia pomonella(L.)是世界范圍內(nèi)蘋果和梨等薔薇科果樹的重要害蟲之一，是我國重要的入侵生物和檢疫害蟲(杜磊等，2012；努爾古麗·馬坎等，2014；Garczynskiet al.，2011；Wearinget al.，2011)。1953年在我國新疆庫爾勒首次發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾，其初孵幼蟲蛀入果實內(nèi)部為害直至老熟幼蟲脫果，以老熟幼蟲在樹皮裂縫等隱蔽處越冬，對環(huán)境具有很強的適應能力(徐婧等，2012；張學祖，1957；周昭旭等，2008)。目前，該害蟲正從西北地區(qū)(新疆、甘肅)和東北地區(qū)(黑龍江、吉林)蔓延至蘋果適生區(qū)和主產(chǎn)區(qū)，對這些地區(qū)的蘋果產(chǎn)量和品質構成嚴重威脅(張潤志等，2012)。

由于化學藥劑防治帶來的抗藥性、環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留問題，應用赤眼蜂Trichogramma chilonisIshii(王蘭等，2011；Stefet al.，2010)、斯氏科線蟲Steinernema carpocapsae(Weiser)(Laceyet al.，2003)、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis(Berliner)(liuet al.，2013)、蘋果蠹蛾顆粒體病毒(Cydia pomonellagranulovirus，CypoGV)(Berlinget al.，2009；Lawrenceet al.，2008)等生物防治技術控制蘋果蠹蛾發(fā)展迅速。在歐美等地已有10種蘋果蠹蛾顆粒體病毒制劑(SAN 406、Virosoft、CarpovirusineTM evo2、CarpovirusineTM 2000、CYD-XHP、MadexTM Biocontrol、GranupomTM、CarpovirusineTM、Cyd-XTM、Virosoft CP4等)被登記(南宮自艷等，2014；Lacey＆Arthurs，2005)。我國利用CypoGV防治蘋果蠹蛾研究起步較晚，目前已分離到CypoGV-ZY、CypoGV-CJ01、CypoGV-KS1、CypoGVKS2、CypoGV-C1等本土病毒株系，并完成了室內(nèi)毒力及田間防治效果試驗(甘恩宇等，2011；申建茹等，2012；liuet al.，2013)。2013年CypoGV-ZY(張掖株)病毒殺蟲劑制劑技術獲得國家發(fā)明專利(專利號201010013631.9)。這些研究成果為我國CypoGV商業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

昆蟲桿狀病毒進入昆蟲體內(nèi)后，通常需要7～10 d才能殺死寄主，添加助劑可提高其田間防效和持久性。研究證實，添加幾丁質酶和BtCry1Ab毒素蛋白能分別縮短LT50和LT90(劉強等，2010；呂婷婷等，2013)；氧化鐵(黑色)和增白劑能提高其他昆蟲桿狀病毒的紫外線耐受性(Asano，2005；Doughertyet al.，1996)；添加紫外線保護劑二氧化鈦和氧化鋅能提高CopyGV對紫外線的抵抗力(Wuet al.，2015)。本研究利用氧化鐵作為CypoGV-ZY在田間的保護增效劑，研究其對病毒毒力和活性的影響，為開發(fā)新型商業(yè)化CypoGV-ZY制劑及其田間應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

蘋果蠹蛾為本試驗在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院建立的室內(nèi)種群，已連續(xù)飼養(yǎng)20多代。先收集蟲卵，進入黑頭期后用NaClO表面消毒，選擇孵化8～12 h的幼蟲為供試蟲源。試蟲飼養(yǎng)條件參數(shù)：(25± 0.5)℃、RH(60±7)%、16 h∶8 h(L∶D)，幼蟲取食的半人工飼料參照樊江斌等(2015)方法制備。

1.2 CypoGV-ZY及氧化鐵

蘋果蠹蛾顆粒體病毒CypoGV-ZY由西北農(nóng)林科技大學植物保護學院分子病毒學實驗室保存，在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院擴繁并純化，制成濃度1× 1010OBs·mL－1，4℃保存。氧化鐵購自天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠。

1.3 試驗方法

微量氧化鐵15 mg·mL－1飼喂試蟲，將2 μL該化合物添加到體積約4.5 mm3的飼料塊內(nèi)，待初孵幼蟲取食完全后更換新飼料塊。測定30頭，供試幼蟲均未中毒死亡，表明低劑量氧化鐵對蘋果蠹蛾初孵幼蟲無明顯毒性。因此本試驗選取氧化鐵濃度3～12 mg·mL－1。設置CypoGV-ZY和蒸餾水2個對照。

1.3.1 氧化鐵對CypoGV-ZY保護增效作用的室內(nèi)生測 配制1×104OBs·mL－1的CypoGV-ZY(Wuet al.，2015)與不同濃度的氧化鐵混勻液，氧化鐵終濃度分別為3、5、7、10、12 mg·mL－1。病毒混合液在小培養(yǎng)皿中避光自然晾干，然后將其置于UVB紫外燈管(40 W)下照射4 h，再加入等體積蒸餾水。以未添加氧化鐵的病毒為對照。滴加2 μL上述病毒懸液至4.5 mm3飼料塊上，幼蟲取食完飼料塊后，添加新鮮飼料，逐日記錄死亡和存活蟲數(shù)，直至所有幼蟲死亡或化蛹。參照Eberleet al.(2009)計算7 d內(nèi)死亡率，按照Abbort(1987)方法計算校正死亡率。每個處理30頭幼蟲，3個重復。

1.3.2 氧化鐵對CypoGV-ZY保護增效作用的田間試驗 病毒強日照田間處理選擇在我國日照強烈的新疆地區(qū)進行。向1×106OBs·mL－1的CypoGV中添加氧化鐵，制成氧化鐵終濃度分別為3、5、7、10、12 mg·mL－1的混合液。將混合液轉移到培養(yǎng)皿中自然晾干，然后移至新疆塔里木大學蘋果園中，選擇強日照天氣處理7 d后，用同體積蒸餾水重懸浮病毒氧化鐵混合液。設置未添加氧化鐵的日光處理的病毒為對照。毒力測定參照1.3.1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0(SPSS Inc，USA)進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan氏多重比較分析不同處理間的差異顯著性。采用GraphPad Prism 5繪圖軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 氧化鐵對CypoGV-ZY的室內(nèi)保護增效作用

室內(nèi)生測結果表明，添加不同濃度氧化鐵的病毒經(jīng)UVB處理4 h后，對蘋果蠹蛾初孵幼蟲的死亡率明顯高于未添加氧化鐵的對照組，差異極顯著(F5，12＝22.24，P＜0.01)(圖1A)。當氧化鐵濃度為7 mg·mL－1時，幼蟲死亡率最高(70.77%)，與氧化鐵濃度5 mg·mL－1相比，幼蟲死亡率差異不顯著(P＞0.05)，但比未添加病毒的處理增加了53.88%。UVB照射病毒后幼蟲存活率53.33%(圖1B)，添加5 mg·mL－1氧化鐵后再被UVB照射，幼蟲存活率降至33.33%，而未被UVB照射的對照組幼蟲存活率僅為13.33%，表明低劑量氧化鐵能幫助病毒抵抗UVB傷害，進而提高其對宿主昆蟲的毒力。

圖1 不同濃度氧化鐵對CypoGV-ZY的增效作用(室內(nèi))Fig.1 The enhancement on Cydia pomonella granulovirus virulence at different concentrations of Fe2O3under laboratory conditions

2.2 氧化鐵對CypoGV-ZY的田間保護增效作用

昆蟲病毒制劑在田間應用過程中，強紫外線容易殺死病毒，減弱病毒制劑在田間的防治效果。圖2表明添加氧化鐵的病毒經(jīng)強日照處理，對蘋果蠹蛾初孵幼蟲的死亡率明顯高于未添加氧化鐵的對照組，并隨著氧化鐵濃度增加，差異極顯著(F5，12＝36.23，P＜0.01)，表明添加氧化鐵能提高病毒對強日照環(huán)境的抵抗力及田間持久性。向CypoGV-ZY添加氧化鐵終濃度7 mg·mL－1，初孵幼蟲死亡率70.77%，比對照提高了96.64%。

3 討論

昆蟲桿狀病毒具有寄主專化性和非靶標生物安全的特點，目前被廣泛應用于害蟲防治。但病毒離開活體寄主，其活性在外界環(huán)境中受到多種非生物因子的影響。

圖2 不同濃度氧化鐵對CypoGV-ZY的增效作用(田間)Fig.2 The enhancement on Cydia pomonella granulovirus virulence at different concentrations of Fe2O3under field essay

紫外線(UV)是一種嚴重影響核型多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)和顆粒體病毒(Granulosis virus，GV)活性和持久性的非生物因素之一。通過添加吸收劑和反射劑等紫外線保護劑，能夠阻止UV到達病毒體上，減弱UV對病毒造成的傷害(Wuet al.，2015)。Jaques(1971)驗證了29種物質都可作為粉紋夜蛾核型多角體病毒的UV保護劑。

室內(nèi)研究表明，UV造成CypoGV失活是一個雙峰曲線，大部分(約99%)病毒很快失去活性，而少部分表現(xiàn)為持久活性(Huber＆Luedcke，1996)。二氧化鈦和氧化鐵能增強Helicoverpa zeaNPV及Homona magnanimaGV在UV下的穩(wěn)定性，從而提高病毒活性和持久性(Asano，2005；Farraret al.，2003)。病毒生測試驗結果證明，UV處理時添加1～4 mg·mL－1氧化鐵，能夠減少1/6～1/18的病毒失活(Asano，2005)。本研究中，未添加氧化鐵保護劑的CypoGV被UVB照射后，幼蟲存活率53.33%，而添加5 mg·mL－1氧化鐵的CypoGV，UVB再處理時，幼蟲存活率降低至33.33%。田間應用表明，噴霧3 d后CypoGV感染活性減半，而在4～8周后部分CypoGV仍持有感染活性(Glen＆Payne，1984)。添加木質素、二氧化鈦和蔗糖的CypoGV制劑比商業(yè)化添加甘油的CypoGV制劑(Cyd-X)，能夠保護病毒免受紫外線傷害，使蘋果蠹蛾的死亡率提高26%～27%(Arthurset al.，2006)。本研究通過室內(nèi)和田間生測，表明添加氧化鐵可提高CypoGV對UVB抵抗力。隨著氧化鐵濃度增加，幼蟲死亡率先升后降，可能是因為高濃度氧化鐵影響病毒入侵昆蟲中腸細胞。當氧化鐵濃度為7 mg·mL－1時，顯著增強了CypoGV的活性和持久性；初孵幼蟲存活率曲線也證明氧化鐵對CypoGV具有保護作用，它能減弱UV對病毒的損害，提高CypoGV的防治效果。研究表明，氧化鐵可作為CypoGV的添加劑，增強CypoGV對蘋果蠹蛾的田間防治效果，這為我國CypoGV制劑本土化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

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(責任編輯：郭瑩)

Synergic enhancement of Cydia pomonella granulovirus virulence using an adjuvant

Jiang-bin FAN，Zheng-wei WU，Guo-feng LIU，Dun WANG?
Key Laboratory of Plant Protection Resources＆Pest Management of the Ministry of Education，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China

【Background】Cydia pomonella(L.)is a worldwide major fruit-boring pest of rosaceae family such as apples and pears. It has so far infested Xinjiang，Gansu，Heilongjiang，Ningxia，Inner Mongolia，Jilin，and Liaoning provinces，China.This pest is spreading towards the major apple production areas，which can result in a great threat to apple industry in China.CypoGV is considered the best biological agent to control codling moth(C.pomonella)in Europe and America.It is important to develop domestic CypoGV commercial agents to protect apple production in China.【Method】The virulence to neonate larvae were tested in laboratory and field bioassay using the mixtures of CypoGV-ZY with different Fe2O3concentrations(3，5，7，10，12 mg·mL－1)treated with UV，and sunlight.【Result】The virulence and persistence of CypoGV-ZY were significant increased when mixed with 7 mg·mL－1Fe2O3in both bioassays.It also enhanced CypoGV-ZY adaptability to strong UV and sunlight.Compared to control of CypoGV-ZY，mortality rate increased 53.88%and 96.64%，in laboratory and field bioassay，respectively.【Conclusion and significance】The virulence and persistence of CypoGV-ZY were markedly enhanced by adding low dose of Fe2O3，which showed that this compound was a proper candidate adjuvant for CypoGV-ZY.The results will provide the basis for commercial production of CypoGV-ZY.

Fe2O3；UV；bioassay；survival rate；synergistic agent

10.3969/j.issn.2095-1787.2015.04.010

2015－06－20 接受日期(Accepted)：2015－07－18

國家自然科學基金(31170609、31270691)

樊江斌，男，碩士研究生。研究方向：昆蟲生理生化。E-mail：fanjiangbin1987＠sina.com?

Author for correspondence)，E-mail：wanghande＠nwsuaf.edu.cn