郭旭光，鄭子棟，郭毅

(河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003)

高效液相色譜梯度洗脫法測定水楊酸復(fù)合洗劑中的有關(guān)物質(zhì)

郭旭光，鄭子棟，郭毅

(河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003)

目的 建立梯度洗脫的高效液相色譜(HPLC)法測定水楊酸復(fù)合洗劑中的有關(guān)物質(zhì)。方法 采用Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.5%磷酸溶液(A)、甲醇(B)為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為270 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果 該方法可快速有效分離水楊酸復(fù)合洗劑中各有關(guān)物質(zhì)。結(jié)論 該方法準確、靈敏、快速、專屬性強，可以用于控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

水楊酸復(fù)合洗劑；梯度洗脫；色譜法，高效液相

水楊酸復(fù)合洗劑具有止癢、殺菌的作用，用于真菌感染的手、足癬的治療，療效好，價格便宜?，F(xiàn)行水楊酸復(fù)合洗劑的質(zhì)量標準沒有對其有關(guān)物質(zhì)進行檢定[1]，筆者參考相關(guān)文獻采用高效液相色譜梯度洗脫法對水楊酸復(fù)合洗劑的有關(guān)物質(zhì)進行了測定[2-10]，本方法快速，簡便，準確，可以更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);G1314A VWD可變波長檢測器(美國Agilent公司)；Agilent chem Station色譜工作站。

1.2 試藥 苯甲酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100419-200301，含量：100%)，水楊酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100106-201104，含量：100%)，4-羥基苯甲酸對照品(Acros公司，批號：A0282187，含量：99.8%)，4-羥基異酞酸對照品(東京化成工業(yè)株式會社，批號：DLTTC，含量：99.4%)，苯酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100509-200902，含量：100%)，水楊酸復(fù)合洗劑(市售，批號：130101，130102，130103)，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為0.5%磷酸溶液，流動相B為甲醇，線性梯度洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為270 nm；進樣體積為10 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性實驗 取苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸及苯酚對照品適量，置同一量瓶中，用0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解稀釋制成濃度為16 μg·mL-1的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液，按上述色譜條件測定。結(jié)果表明，相鄰峰的分離度均>1.5。

表1 梯度洗脫程序

%

2.3 專屬性實驗

破壞性實驗 儲備液的制備：精密稱取粉劑300 mg，置20 mL量瓶中，用0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻。

酸破壞：精密量取儲備液2 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol·L-1鹽酸1 mL放置2 h后用1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)pH至中性，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定。

堿破壞：精密量取儲備液2 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol·L-1氫氧化鈉1 mL放置2 h后用1 mol·L-1鹽酸調(diào)pH至中性，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定。

氧化破壞：取儲備液2 mL，置5 mL量瓶中，加30%過氧化氫1 mL，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，放置0.5 h后，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定。

高溫破壞：取儲備液2 mL，置5 mL量瓶中，60 ℃水浴2 h，放至室溫，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定。

光照破壞：取儲備液2 mL，置5 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，于4 000 lx光照2 h，放至室溫，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定。

結(jié)果各破壞條件下的降解物與主峰分離均良好。

2.4 線性范圍考察 精密稱取苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚對照品各20 mg置同一50 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于50 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取0.5，2.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL分別置10 mL量瓶中，加0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，以濃度C(μg·mL-1)對峰面積A進行線性回歸，分別得苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚的線性回歸方程：

A=2.720 4C+0.320 1，R2=0.999 9(n=6)；

A=3.479 5C+0.675 4，R2=0.999 6(n=6)；

A=63.047C+6.185 5，R2=0.999 8(n=6)；

A=37.58C-3.457 1，R2=0.999 9(n=6)；

A=3.292 3C+0.459 6，R2=0.999 8(n=6)。

結(jié)果表明，苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚分別在2.109～37.962 μg·mL-1、1.989～35.802 μg·mL-1、1.982～35.676 μg·mL-1、2.018～36.324 μg·mL-1和2.234～40.212 μg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗 取“2.2”項下的系統(tǒng)適用性實驗溶液，分別連續(xù)進樣6次，按“2.1”項色譜條件進行分析，記錄色譜圖，測得苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚峰面積的RSD 分別為0.8%，0.5%，0.6%，0.5%和0.4%，結(jié)果表明此法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 精密稱取水楊酸復(fù)合洗劑(批號：130101)6份，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定6份樣品有關(guān)物質(zhì)總峰面積、雜質(zhì)個數(shù)、單個雜質(zhì)量、雜質(zhì)總量。結(jié)果總峰面積平均值為14 536.5，RSD為0.9%；雜質(zhì)個數(shù)均為5個；單個雜質(zhì)量基本沒有變化；雜質(zhì)總量平均值為0.55%，RSD為0.2%。

2.7 檢測限和定量限 以信噪比為3：1，測得苯甲酸、水楊酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚檢測限分別為4.22，3.98，0.124，0.448和4.47 ng；定量限分別為12.78，12.06，0.37，1.49和13.45 ng。

2.8 溶液穩(wěn)定性 選取2批樣品(批號：130101，130102)進行考察。結(jié)果顯示，供試品溶液在常溫下放置24 h，2批樣品的雜質(zhì)峰數(shù)目、單個雜質(zhì)的峰面積和雜質(zhì)總量均無變化(RSD=0.04%)，說明溶液在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性 選用2根不同品牌的C18柱，Agela Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，在2臺儀器(Agilent 1100型高效液相色譜儀和Waters 2695型高效液相色譜儀)上測定3批樣品的有關(guān)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱檢測到的雜質(zhì)數(shù)目、出峰順序、分離效果和峰面積均無明顯變化。

2.10 樣品測定 取本品適量，精密稱定，用0.5%磷酸溶液：甲醇(1：1)混合溶液定量稀釋制成每毫升中含水楊酸約2 mg的溶液，搖勻，用孔徑0.2 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，0.5%磷酸溶液：甲醇(1：1)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)孔徑0.2 μm濾膜濾過，將濾液作為對照溶液。按上述色譜條件測定，分別取對照溶液及供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰的峰面積不得大于對照溶液中水楊酸主峰面積的0.5倍；各雜質(zhì)峰的面積之和不得大于對照溶液中水楊酸峰面積的3倍。用自身對照法計算各雜質(zhì)的含量，3批有關(guān)物質(zhì)均符合規(guī)定，見表2。

3 討論

筆者比較了4種不同流動相系統(tǒng)：①甲醇-水-冰醋酸(60：40：1)[2]；②甲醇-水-冰醋酸(40：60：1)[3]；③20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用20%磷酸調(diào)節(jié)pH為2.7)-甲醇(40：60)；④以0.5%磷酸溶液

表2 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果 %

(A)、甲醇(B)為流動相，梯度洗脫。結(jié)果流動相①、②和③部分色譜峰的分離度<1.5，并且基線較高且有漂移，半峰寬較大，峰拖尾因子不理想，水楊酸峰后出現(xiàn)一較大寬峰；采用流動相④梯度洗脫后基線漂移現(xiàn)象得到改善，水楊酸后的大寬峰得以改善，主峰及各雜質(zhì)峰之間均分離良好；筆者嘗試用0.5%三氟乙酸溶液和0.5%醋酸溶液替代流動相④中的0.5%磷酸溶液進行梯度洗脫實驗，結(jié)果流動相A為0.5%三氟乙酸溶液時圖譜中各峰的分離度均>4.0，分離度較好且柱效高，但是基線噪音大；用0.5%醋酸溶液以同樣梯度洗脫，結(jié)果苯甲酸和水楊酸分離不完全。嘗試改變梯度程序，主峰保留時間、檢出雜質(zhì)峰個數(shù)及分離度均有所不同，綜合考慮以上因素并結(jié)合柱效和拖尾因子，最終確定流動相④的梯度洗脫程序最優(yōu)，筆者選擇流動相④梯度洗脫作為該產(chǎn)品流動相系統(tǒng)。

分別精密稱取兩份水楊酸復(fù)合洗劑樣品(批號：130101)分別用溶劑A[0.5%磷酸溶液-甲醇(1：1)混合溶液]和溶劑B(50%甲醇)稀釋制成每毫升含水楊酸約2 mg的溶液，按本文色譜條件進樣，結(jié)果溶劑B稀釋的樣品色譜圖中苯甲酸和水楊酸兩主峰分離不完全；用溶劑A稀釋后的色譜圖，主峰之間及與雜質(zhì)峰均分離完好，故確定溶劑A為本文方法溶劑。

采用DAD檢測器對供試品溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰和主峰的最大紫外吸收進行測定，經(jīng)實驗圖譜中各峰的紫外吸收主要集中在254，270和230 nm附近，在這3個波長處，各雜質(zhì)的吸收大小程度不同，分別對同一份供試品進行有關(guān)物質(zhì)測定，結(jié)果表明在270 nm波長處單個雜質(zhì)峰的面積百分比均較大，檢出的總雜質(zhì)量最多，為了更多地檢出雜質(zhì)，更有效地控制該產(chǎn)品質(zhì)量，選擇270 nm為有關(guān)物質(zhì)檢測波長。

本品的藥效成分是苯甲酸、水楊酸、硼酸和乳酸。苯甲酸和水楊酸具有紫外吸收，筆者依此并參考相關(guān)文獻建立了高效液相色譜梯度洗脫法測定其有關(guān)物質(zhì)[2-10]，因硼酸和乳酸沒有紫外吸收，其有關(guān)物質(zhì)暫時還沒有檢測方法；4-羥基苯甲酸、4-羥基異酞酸和苯酚均為已知雜質(zhì)，含量均<0.5%，其他雜質(zhì)檢出量均非常微小，本研究共檢出兩個單個未知雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和歸屬有待進一步研究，兩個未知單個雜質(zhì)均暫以主成分水楊酸峰面積計算。參照《中華人民共和國藥典》[2]水楊酸原料標準中對雜質(zhì)A(4-羥基苯甲酸)、雜質(zhì)B(4-羥基異酞酸)、雜質(zhì)C(苯酚)的限度規(guī)定，確定本品單個雜質(zhì)的限度不超過0.5%，以更好地控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

破壞性實驗表明本品在強酸堿和氧化條件下均有降解，光破壞和高溫破壞幾乎沒有降解，說明儲存過程中要避免強酸堿條件并應(yīng)密封保存，考慮到苯甲酸和水楊酸均為小分子物質(zhì)，降解后可能沒有紫外吸收，所以有關(guān)物質(zhì)和含量測定相結(jié)合以進行質(zhì)量評價更有意義。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.026

2014-02-21

2014-04-26

郭旭光(1972-)，男，河南襄城人，主管藥師，碩士，主要研究方向：食品、藥品質(zhì)量控制。電話：0371-63388290，E-mail：gxg0371@126.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0664-03