丁沐陽(yáng)，蔣文軍，張 力，崔雨蒙，張 航，史麗云，高艷娥

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004；2.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310012）

EZH2抑制劑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用

丁沐陽(yáng)1，蔣文軍1，張 力1，崔雨蒙1，張 航2，史麗云2，高艷娥1

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004；2.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310012）

目的 探討EZH2（enhancer of zeste homolog 2）抑制劑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。方法 將EZH2抑制劑GSK343作用于體外培養(yǎng)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，用MTT及克隆形成率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力的變化，Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)；同時(shí)以等體積GSK343溶劑DMSO為對(duì)照。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，GSK343對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，呈時(shí)間依賴性；克隆形成和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，GSK343能顯著抑制HeLa細(xì)胞的增殖及遷移能力；Western blot結(jié)果顯示，GSK343處理后細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯增高，間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin表達(dá)明顯減低。結(jié)論 EZH2抑制劑GSK343可抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖與遷移，其機(jī)制之一可能是通過抑制HeLa細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來實(shí)現(xiàn)的。

EZH2抑制劑；宮頸癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖與遷移；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

宮頸癌（cervical cancer）是全世界范圍內(nèi)威脅女性健康的第二大惡性腫瘤，在腫瘤相關(guān)死亡疾病中排名第四［1］。惡性腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與、多階段相互作用的過程。目前，惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制眾說紛紜。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤進(jìn)展的重要事件，其以上皮細(xì)胞極性的喪失并獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型和運(yùn)動(dòng)能力為特征，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。

果蠅zeste基因增強(qiáng)子（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是一種甲基化酶，屬于PRC2（polycomb repressive complex 2）復(fù)合物中重要的催化亞基，能夠使組蛋白27位賴氨酸發(fā)生3甲基化，從而發(fā)揮表觀遺傳學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在宮頸癌組織中存在異常高表達(dá)，可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等過程［2］。

本研究將EZH2抑制劑GSK343作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞，檢測(cè)HeLa細(xì)胞在增殖轉(zhuǎn)移等方面的改變，探討EZH2抑制劑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑人宮頸癌細(xì)胞株He La購(gòu)自美國(guó)ATCC；EZH2抑制劑GSK343購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，按照說明書溶于DMSO中使?jié)舛葹? mol/L，分裝后-80℃冰箱保存；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清及2.5 g/L胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青-鏈霉素溶液購(gòu)自杭州吉諾生物公司；兔抗E-cadherin、N-cadherin及鼠抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；MTT［3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽］、Giemsa染料及Ripa裂解液，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒為上海博彩生物公司產(chǎn)品；軟瓊脂購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組將HeLa細(xì)胞置于含100 m L/L胎牛血清及1×青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2.5 g/L胰酶消化，離心棄上清，重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)不同目的的實(shí)驗(yàn)分別接種于6孔板、96孔板及100 mm培養(yǎng)皿中，同時(shí)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組即EZH2抑制劑GSK343處理組（EZH2 inhibitor，EI），將EZH2抑制劑GSK343保存液稀釋于含100 m L/L胎牛血清及1×青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，至作用濃度50μmol/L；對(duì)照組（negative control，NC）則在相同培養(yǎng)基中加入同體積溶劑DMSO。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用胰酶消化、培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔細(xì)胞約5×103個(gè)，補(bǔ)充培養(yǎng)基至每孔200μL，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組（EI），等體積溶劑DMSO處理組作為對(duì)照（NC）。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10μL MTT（終質(zhì)量濃度5 mg/m L），37℃孵育4 h后加入DMSO，分光光度計(jì)測(cè)各孔在490 nm的吸光度值（A），繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 克隆形成率的計(jì)數(shù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的He La細(xì)胞，用胰酶消化、培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，將軟瓊脂與培養(yǎng)基1∶1混勻后，加入EZH2抑制劑GSK343制備的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基，使作用濃度為50μmol/L；對(duì)照組（NC）培養(yǎng)基含等體積DMSO。鋪于6孔板中，每孔200個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d后，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。每孔用100 g/L Giemsa溶液500μL染色20 min，置于低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞數(shù)的集落數(shù)。每孔取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的He La細(xì)胞，用胰酶消化、培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于6孔板中（每孔4×105個(gè)），實(shí)驗(yàn)組（EI）與對(duì)照組（NC）分別換用相應(yīng)的培養(yǎng)基，置于37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用200μL槍頭垂直劃線，1×PBS沖洗3遍后兩組均加入含100 m L/L EBS的DMEM培養(yǎng)基，于24 h后顯微鏡下照相，比較劃痕空隙間細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。

1.6 Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的He La細(xì)胞，用胰酶消化、培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于6孔板中（每孔4×105個(gè)），分為實(shí)驗(yàn)組（EI）與對(duì)照組（NC），置于37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定提取蛋白濃度。取80μg蛋白質(zhì)100 g/L SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDE膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封膜1 h，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗E-cadherin及N-cadherin，4℃過夜，TBST洗膜后，加入相應(yīng)的辣根過氧物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。以β-actin為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)之間的差異性比較采用單因素等方差t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EZH2抑制劑GSK343對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)增殖力的抑制作用MTT結(jié)果顯示，隨時(shí)間推移，實(shí)驗(yàn)組（EI）細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組（NC），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1），GSK343對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制呈時(shí)間依賴性（圖2）。細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，細(xì)胞接種12 d以后，EZH2抑制劑處理組克隆數(shù)量為24±1.741，顯著少于對(duì)照組的（42±1.345），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。以上結(jié)果提示，EZH2抑制劑具有明顯抑制人宮頸癌He La細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力。

圖1 實(shí)驗(yàn)組（EI）與對(duì)照組（NC）處理后吸光值的變化Eig.1 Changes of optical density（A）measured after EZH2 inhibitor or vehicleadministration

圖2 實(shí)驗(yàn)組（EI）與對(duì)照組（NC）處理后細(xì)胞生長(zhǎng)率的變化Eig.2 Changes of cell viability after EZH2 inhibitor or vehicle administration

圖4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合情況的對(duì)比Eig.4 Comparison of wound healing between the two groups

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組克隆形成的對(duì)比Eig.3 Changes of clone formation rate after EZH2 inhibitor or vehicle administration**P＜0.01。

2.2 EZH2抑制劑GSK343對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移能力的抑制作用細(xì)胞經(jīng)劃痕處理24 h后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)變化。對(duì)照組劃痕區(qū)域細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞形態(tài)正常，占據(jù)空隙面積較大，為（72.415± 1.326）%；實(shí)驗(yàn)組劃痕區(qū)域細(xì)胞生長(zhǎng)呈局限性，細(xì)胞形態(tài)較小，占據(jù)空隙面積為（49.99±1.252）%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。提示EZH2抑制劑可以明顯抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移能力。

2.3 EZH2抑制劑GSK343對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞上皮間質(zhì)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響用EZH2抑制劑GSK343預(yù)處理HeLa細(xì)胞48 h后（EI），上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)較對(duì)照組（NC）明顯升高，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin表達(dá)明顯降低（圖5）。說明EZH2抑制劑處理He La細(xì)胞48 h后，細(xì)胞較對(duì)照組更呈現(xiàn)出上皮特征改變，提示EZH2抑制劑可以明顯抑制He La細(xì)胞的EMT改變。

3 討 論

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致臨床宮頸癌患者死亡的主要原因。因此，如何減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)患者的生存期和提高其生活質(zhì)量是我們需要解決的關(guān)鍵問題。目前，研究認(rèn)為宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展是多基因作用、多因素參與和多階段發(fā)展的病理過程，涉及眾多癌基因的激活與抑癌基因的異常。

圖5 實(shí)驗(yàn)組（EI）與對(duì)照組（NC）E-cadherin and N-cadherin的Western blot結(jié)果Eig.5 E-cadherin and N-cadherin expressions determined by Western blot assay

近來研究表明，表觀遺傳調(diào)控因子PcG蛋白表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展密切相關(guān)。EZH2基因在PcG基因家族中起著核心作用。EZH2通過對(duì)核小體組蛋白H3的9、27位賴氨酸進(jìn)行甲基化修飾抑制抑癌基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用，其高表達(dá)提示預(yù)后不良［3］。EZH2具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；负投喾N基因外的調(diào)控作用，參與基因的轉(zhuǎn)錄抑制，通過抑制染色質(zhì)中的靶基因而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，其在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中都有異常高表達(dá)，可能參與了腫瘤的增值、侵襲與轉(zhuǎn)移等過程［4］。

目前，很多研究支持EZH2在多種惡性腫瘤的發(fā)展過程中充當(dāng)致癌基因，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等相關(guān)機(jī)制。在EZH2敲除的前列腺癌細(xì)胞系中，腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲能力明顯降低。EZH2抑制劑3-Deazaneplanocin A（DZNep）可以顯著加速腫瘤細(xì)胞的凋亡而不影響正常細(xì)胞，明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力［5-6］。一些高選擇性的小分子EZH2抑制劑已經(jīng)被研制出來，如EPZ-6438、EPZ005687、EI1以及本研究中的GSK343等，這些抑制劑可以高效地抑制淋巴瘤Y641的EZH2活性。目前，EPZ-6438已臨床試驗(yàn)用來治療B細(xì)胞淋巴瘤及一些實(shí)體腫瘤［7］。本研究提示，EZH2抑制劑作用于宮頸癌HeLa細(xì)胞后，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)處理48 h及72 h均能明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖與遷移能力；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EZH2抑制劑處理組的克隆形成數(shù)量顯著低于對(duì)照組；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EZH2抑制劑預(yù)處理后細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)說明，EZH2抑制劑具有抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移能力。

有研究表明，在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移初始階段，腫瘤上皮細(xì)胞即可發(fā)生EMT，相應(yīng)地抑制或逆轉(zhuǎn)EMT可抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。EMT的發(fā)生，可促使腫瘤發(fā)生早期的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其中E-cadherin蛋白的分解是促使細(xì)胞發(fā)生EMT的一個(gè)關(guān)鍵步驟。KRISHNAMACHARY等人［9］研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin蛋白表達(dá)缺失在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的中起重要作用。另有研究表明，N-cadherin可以通過抗凋亡機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)［10］。在前列腺癌、惡性黑色素瘤中，E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；而且，E-cadherin的缺失可以誘導(dǎo)N-cadherin的表達(dá)［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EZH2抑制劑處理人宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h后，E-cadherin蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，N-cadherin的表達(dá)明顯抑制，提示EZH2抑制劑可以抑制HeLa細(xì)胞的EMT過程。提示EZH2抑制劑抑制HeLa細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制之一為抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的EMT過程，它有可能成為有效抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要手段。這提示我們?cè)谖磥磉M(jìn)一步的研究中，應(yīng)將重點(diǎn)放在轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白與EZH2活性的相互作用關(guān)系的研究上。

本研究提示的EZH2與EMT相關(guān)表型與潛在機(jī)制對(duì)宮頸癌認(rèn)識(shí)和治療具有深遠(yuǎn)的指導(dǎo)意義。提示，通過特異性的抑制劑作用這條通路，可以導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)的再修飾，包括E-cadherin蛋白的表達(dá)上調(diào)。使侵襲性的宮頸癌細(xì)胞向低侵襲性的具有上皮特性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能作為未來的抑制腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)變EZH2生物活性的長(zhǎng)遠(yuǎn)策略。

［1］JEMAL A，BRAY F，CENTER MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：6990.

［2］劉瑩，高慶，高艷娥，等.宮頸癌中EZH2的表達(dá)與細(xì)胞增殖和血管生成的關(guān)系［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，34（5）：580-584.

［3］KHAN SN，JANKOWSKA AM，MAHFOUZ R，et al.Multiple mechanisms deregulate EZH2 and histone H3 lysine 27 epigenetic changes in myeloid malignancies［J］.Leukemia，2013，27（6）：1301-1309.

［4］HIROHITO Y，MIEN-CHIE H.Regulation and role of EZH2 in cancer［J］.Cancer Res Treat，2014，46（3）：209-222.

［5］ALIMOVA I，VENKATARAMAN S，HARRIS P，et al.Targeting the enhancer of zeste homologue 2 in medulloblastoma［J］.Int J Cancer，2012，131（8）：1800-1809.

［6］KEMP CD，RAO M，XI S，et al.Polycomb repressor complex-2 is a novel target for mesothelioma therapy［J］.Clin Cancer Res，2012，18（1）：77-90.

［7］KNUTSON SK，KAWANO S，MINOSHIMA Y，et al.Selective inhibition of EZH2 by EPZ-6438 leads to potent antitumor activity in EZH2-mutant non-Hodgkin lymphoma［J］.Mol Cancer Ther，2014，13（4）：842-854.

［8］GUARINO M.Epithelial mesenchymal transition and tumor invasion［J］.Int J Biochen Cell Bio，2007，39（12）：2153-2160.

［9］KRISHNAMACHARY B，ZAGZAG D，NAGASAWA H，et a1. Hypoxia-inducible factor-1-dependent repression of E.cadherin in von Hippel-Lindau tumor suppressor-null renal cell carcinoma mediated by TCF3，ZFHZl A，and ZFHZlB［J］.Cancer Res，2006，66（5）：2725-2731.

［10］GWAK GY，YOON JH，YU SJ，et a1.Anti-apoptotic N-cadherin signaling and its prognostic implication in human hepatocellular carcinomas［J］.Oncol Rep，2006，15（5）：1117-1123.

［11］KUPIIAL S，BOSSERHOFF AK.Influence of the cytoplasmic domain of E-cadherin on endogenous N-cadherin expression in malignant melanoma［J］.Oncogene，2006，25（2）：248-259.

（編輯 卓選鵬）

Inhibitory effect of EZH2 inhibitor on cervical cancer HeLa cells

DING Mu-yang1，JIANG Wen-jun1，ZHANG Li1，CUI Yu-meng1，
ZHANG Hang2，SHI Li-yun2，GAO Yan-e1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004；
2.Medical School，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310012，China）

Objective To explore the inhibitory effect of enhancer of zeste homolog 2（EZH2）inhibitor on the proliferation and migration of cervical cancer He La cells.Methods Cervical cancer He La cells were cultured with the conditioned-medium containing EZH2 inhibitor GSK343 or the same volume of the vehicle DMSO as control.The cell growth rate was measured by MTT assay and cloning formation assay.The cell migration ability was detected by wound scratch assay.Western blot assay was used to test the epithelial-mesenchymal transition related proteins，E-cadherin and N-cadherin.Results MTT assay results showed that GSK343 inhibited the growth of He La cells in a time-dependent manner.Cloning formation and wound scratch assays exhibited that GSK343 dramatically reduced both the proliferation and migration of He La cells.In addition，Western blot assay demonstrated that GSK343-treated cells were associated with upregulation of epithelial marker E-cadherin and downregulation of mesenchymal marker N-cadherin.Conclusion EZH2 inhibitor GSK343 can significantly restrain the proliferation and migration of cervical cancer He La cells，probably by inhibiting the process of epithelial-mesenchymal transition of the cells.

enhancer of zeste homolog 2（EZH2）inhibitor；cervical cancer cell；cell proliferation and migration；epithelial-mesenchymal transition

R737.33

A

10.7652/jdyxb201505012

2014-10-29

2015-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81000956）；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014SE2-19）Supported by the National Natural Science Eoundation of China（No.81000956）and the Sci-tech Program Eoundation of Shaanxi Province（No.2014SE2-19）

高艷娥.E-mail：yanegao@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150721.1051.006.html（2015-07-21）