1.濟(jì)南大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 （山東 濟(jì)南 250022）

2.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 （山東 濟(jì)南 250062）

3.山東省立醫(yī)院 （山東 濟(jì)南 250021）

4.天津市武清區(qū)人民醫(yī)院骨三科 （天津 301700）

韓 峰1,2魯艷芹2王延宙3任秀智4石賢龍1,2韓金祥2

·系統(tǒng)性疾病·

IFITM5在不同癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)*

1.濟(jì)南大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 （山東 濟(jì)南 250022）

2.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 （山東 濟(jì)南 250062）

3.山東省立醫(yī)院 （山東 濟(jì)南 250021）

4.天津市武清區(qū)人民醫(yī)院骨三科 （天津 301700）

韓 峰1,2魯艷芹2王延宙3任秀智4石賢龍1,2韓金祥2

目的 研究干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白5(IFITM5)在人骨肉瘤15種細(xì)胞系中的表達(dá)。方法 應(yīng)用RT-QPCR和Western blot檢測(cè)IFITM5在SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD等癌細(xì)胞系中mRNA和蛋白表達(dá)差異。結(jié)果 在H7402、RD、HEP2細(xì)胞系中IFITM5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平最低，其他細(xì)胞系次之，在SAOS2和3A0細(xì)胞系中兩者均呈高表達(dá)。結(jié)論 IFITM5在癌細(xì)胞系中存在并有表達(dá)差異，為后續(xù)研究IFITM5在腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。

IFITM5；mRNA；蛋白；癌細(xì)胞系

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因家族(IFITM)于1984年篩選cDNA文庫(kù)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)[1]，其在進(jìn)化上高度保守性。目前已在多個(gè)物種中被發(fā)現(xiàn),其中研究較多的則是人源和鼠源家族。人類包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10等5個(gè)家族成員，這些家族成員均包含一個(gè)保守的CD225域和兩個(gè)終端變異域。其編碼的蛋白質(zhì)在生殖細(xì)胞成熟、細(xì)胞-細(xì)胞粘附、白血病、腫瘤抑制、抗病毒活性、骨形成、胚胎發(fā)育發(fā)揮重要作用。IFITM參與了腫瘤抑制通路，對(duì)癌細(xì)胞具有抗增殖的作用。IFITM肽參與了腫瘤抗原樹突的運(yùn)輸，其蛋白具有腫瘤抑制的性質(zhì)，甚至可以在腫瘤形成之前起調(diào)制作用[2-5]。盡管采用手術(shù)、化療、放療等治療手段使癌癥的存活率有了很大的提高，但晚期患者即使經(jīng)過(guò)系統(tǒng)治療達(dá)到完全緩解，仍有60%～70%會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[6]，而IFITM家族腫瘤抑制作用的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)對(duì)降低癌癥的復(fù)發(fā)率提供一種可能。

IFITM5是干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因家族成員之一，該基因位于人類第11號(hào)染色體11p15.5上，開放閱讀框共399bp，含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為14.8KDa，由132個(gè)氨基酸組成。該蛋白結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)N端和C端以及胞質(zhì)區(qū)的loop，其C端為富含天冬氨酸區(qū)域，可參與Ca2+的結(jié)合[7-8]。IFITM5是一種成骨細(xì)胞標(biāo)記基因，為骨礦化因子[9]，在骨組織和成骨細(xì)胞高表達(dá)，在成纖維細(xì)胞譜系也有低水平的表達(dá),其主要在成骨細(xì)胞中存在，在巨噬細(xì)胞和脾臟中也有少量存在[10]，而IFITM5在癌癥方面的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從基因水平和蛋白水平初步分析了IFITM5在不同癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)，為進(jìn)一步探究IFITM5在癌細(xì)胞系中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1640培養(yǎng)基、McCoy's 5A培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自GIBCO公司，乙醇、甲醇、異丙醇、氯仿購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，TRIzol Reagent 購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物公司，SYBR Green購(gòu)自Roche公司，胰酶細(xì)胞消化液、青霉素—鏈霉素雙抗、細(xì)胞裂解液、磷酸鹽緩沖液、轉(zhuǎn)膜液、PMSF、BCA試劑盒、過(guò)硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、TEMED、Arc-Bis(29：1)、Tris-HCl(pH 8.8，pH 6.8)，5XSDS樣品緩沖液、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、GAPDH多克隆抗體、一抗稀釋液、蛋白顯影定影試劑盒購(gòu)自碧云天公司，PVDF膜購(gòu)自Millipore公司，兔抗IFITM5多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，彩色預(yù)染蛋白marker、ECL發(fā)色液購(gòu)自Thermo公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD細(xì)胞復(fù)蘇后用含有10%FBS、100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(SAOS2細(xì)胞用McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng))，條件為37℃、5%CO2，隔兩天換液一次。

2.2 RT-QPCR測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平RNA提取與分析：收取SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD細(xì)胞，采用TRizol法提取RNA，用DEPC水溶解沉淀獲得細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280的比值，測(cè)定RNA純度和濃度。

RT反應(yīng)體系：采用Random Primers為RT反應(yīng)引物；總反應(yīng)體系為20ul，包括1ug的總RNA，5×PrimeScript Buffer 4ul，RNase Inhibitor(40 U/ul)0.5ul，PrimeScript Reverse Transcriptase(200 U/ul)1ul，RNase free dH2O調(diào)總體積至20ul。30℃ 10min，42℃ 60min，70℃，15min。

圖1 不同癌細(xì)胞系IFITM5/GAPDH的基因相對(duì)差異表達(dá)。圖2 不同癌細(xì)胞系IFITM5和GAPDH的蛋白表達(dá)。圖3 不同癌細(xì)胞系IFITM5/GAPDH的灰度相對(duì)比值。

Real-time PCR反應(yīng)：總反應(yīng)體積為10ul，包括2ul cDNA，2×SYBR I Master 5ul，HGAPDH-F/ HGAPDH-R各1ul或IFITM5-F/IFITM5-R各1ul，RNase free dH2O補(bǔ)足至10ul。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性，95℃10S，60℃ 10s共45個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10S。

2.3 Western blot 檢測(cè)IFITM5的表達(dá) 收集SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌三次，提取細(xì)胞總蛋白，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，超聲破碎后12000rpm離心5min，吸取上清，測(cè)定樣品蛋白濃度后加入5Xloading buffer 100℃煮沸5min使蛋白變性。不同濃度的蛋白樣品取等量蛋白樣品20ug進(jìn)行SDS-PAGE電泳，300mA濕轉(zhuǎn)1.5h，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，TBST洗三遍，一抗4℃過(guò)夜，TBST洗三遍，二抗室溫孵育1h，TBST洗三遍后化學(xué)發(fā)光顯色，利用富士LAS4000mini化學(xué)發(fā)光成像儀自動(dòng)曝光成像顯影。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同癌細(xì)胞系中IFITM5 mRNA表達(dá)差異 RTQPCR結(jié)果顯示：不同癌細(xì)胞系中IFITM5的基因相對(duì)表達(dá)具有顯著性差異，SAOS2、3A0癌細(xì)胞系中IFITM5的基因相對(duì)表達(dá)明顯高于SKOV3、HEPG2等癌細(xì)胞系，其中H7402、HEP2、RD癌細(xì)胞系IFITM5的基因相對(duì)表達(dá)量最低(圖1)。

3.2 不同癌細(xì)胞系中IFITM5蛋白表達(dá)差異Western blot結(jié)果顯示：不同癌細(xì)胞系的蛋白提取液在相對(duì)分子質(zhì)量14.8KD處可檢測(cè)到一條蛋白質(zhì)條帶，其IFITM5蛋白表達(dá)水平不一，其中在人成骨肉瘤(SAOS2)細(xì)胞系中表達(dá)量最高，其次是人卵巢癌(3AO)細(xì)胞系，人肝癌(H7402)細(xì)胞系表達(dá)量最低(圖2)。圖3中目的蛋白IFITM5與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值分析從0到0.45相差較大，具有顯著性差異。

4 討論

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白是干擾素介導(dǎo)的先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它們?cè)谀[瘤抑制中起著一定的作用，這可能與它們控制細(xì)胞周期的能力有關(guān)。細(xì)胞從正常狀態(tài)到癌變過(guò)程中IFITM會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)異常表達(dá)[2]。同一個(gè)人正常組織、癌周組織和癌組織之間基因的表達(dá)存在差異顯著性。不同的癌組織樣本IFITM的表達(dá)高低不一，IFITM水平的上調(diào)或下調(diào)可能依賴于癌組織類型，也可能一起作用于癌細(xì)胞的突變[11-12]。IFITM在不同的腫瘤中可能具有不同的作用，腫瘤發(fā)生涉及細(xì)胞周期控制的失活和DNA損失修復(fù)能力的減弱。DNA損傷修復(fù)能力的缺失導(dǎo)致的DNA倒置、染色體重組等可能有IFITM基因的參與[13]。IFITM基因表達(dá)水平缺失后腫瘤的癥狀就會(huì)明顯，所以該基因被認(rèn)為具有腫瘤抑制作用。然而，多數(shù)癌細(xì)胞解除了對(duì)IFITM基因轉(zhuǎn)錄的控制，表明在癌癥發(fā)展階段至少有一種干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因在抗增殖通路中是保持沉默的[2]，而IFITM5也是干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白基因家族成員之一，其在人類免疫及癌癥形成方面的相關(guān)研究較少，尚有待于進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot對(duì) 15種癌細(xì)胞系進(jìn)行基因和蛋白相對(duì)差異分析，發(fā)現(xiàn)IFITM5在骨腫瘤以及人卵巢癌細(xì)胞系中高表達(dá)。在肝癌H7402與橫紋肌肉瘤RD等細(xì)胞中表達(dá)量低。本研究結(jié)果顯示IFITM5在多種癌細(xì)胞系中存在并有表達(dá)差異，它是否可以作為骨腫瘤以及其它腫瘤的生物標(biāo)記物及其與腫瘤的關(guān)系等尚有待于進(jìn)一步研究。

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Different Expression of IFITM5 in Cancer Cell Lines*

HAN Feng1,2, LU Yan-qin2, WANG Yan-zhou3, et al., 1 School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong; Academy of Medical Sciences, Jinan 250022,China; 2 Shandong Medicinal Biotechnology Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, Shandong, China,et al.

Objective To investigate the expression level of IFN-inducible transmembrane protein 5(IFITM5) in 15 different cancer cell lines.Methods RT-QPCR and Western blot were performed to detect the expression level of IFITM5 in SAOS2,3A0, SKOV3, HEPG2, HEP2, ACCM, HT29, MDA-MB-231, H7402, HELA, HEK-293, HL-60, K562, THP1 and RD cancer cell lines.Results There was remarkable difference in the expression of IFITM5 in this cancer cell lines.The lowest expression level of mRNA and protein were detected in H7402,RD and HEP2 cell lines .The highest IFITM5 expression was observed in SAOS2 cells,followed by 3AO.Conclusions Significant differential expression of IFITM5 in 15 cancer cells was observed, which laid the foundation for further research on the relationship of IFITM5 and tumor.

IFITM5; MRNA; Protein; Cancer Cell Lines

R73-3

A

國(guó)家科技支撐計(jì)劃，課題編號(hào)：2013BAI07B01

2015-03-26

韓 峰，男，藥學(xué)專業(yè)，研究生，主要研究方向：IFITM5基因-14C＞T定點(diǎn)突變?cè)诠丘栊纬芍械淖饔?/p>

韓金祥

DOI∶10.3969/j.issn.1009-3257.2015.02.014