劉超等

摘 要 應用ISSR標記對山西省7個野生居群和1個人工栽培居群共60份西伯利亞遠志種質進行遺傳多樣性分析。結果表明：從100對ISSR引物中共篩選出20條多態(tài)性好、條帶穩(wěn)定的引物，60份材料DNA共獲得338個擴增位點，其中多態(tài)性位點334個，多態(tài)性比率為98.82%；有效等位基因數（Ne）、Nei's基因多樣性指數（H）及Shannon多樣性信息指數（I）分別為1.433 7、0.265 6和0.414 2，居群的遺傳相似度在0.655 2～0.977 9，表明8個居群具有豐富的遺傳多樣性，這與其自身繁殖特點有關；遺傳分化系數（Gst）和基因流（Nm）分別為0.526 0和0.450 5，表明居群內和居群間均有一定程度的分化，基因流水平較低；利用UPGMA法進行聚類分析，將8個居群劃分為3類。研究結果為合理引種、馴化、保護和利用西伯利亞遠志野生資源提供了重要的參考依據和數據支持。

關鍵詞 西伯利亞遠志 ；ISSR ；種質資源 ；遺傳多樣性 ；聚類分析

分類號 Q949.753.3

西伯利亞遠志（Polygala sibirica L.）為遠志科（Polygalaceae）遠志屬（Polygala L.）植物，是多年生草本，高10～30 cm，葉片下部小的為卵形，上部大的為披針形或橢圓狀披針形；總狀花序假頂生或腋外生；花為藍紫色，龍骨瓣較長，具流蘇狀雞冠狀附屬物；蒴果呈倒心形。全國各地均有該物種的分布。

中藥遠志為中國大宗常用藥材，中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會于1977年首次將西伯利亞遠志P. sibirica L.列入《中國藥典》[1]，規(guī)定其和遠志P. tenuifolia Willd.同為藥用遠志的2種基源植物，主治心腎不交所引起的失眠多夢、健忘驚悸、神志恍惚、咳痰不爽、瘡瘍腫毒及乳房腫痛等。關于藥用遠志來源的爭議較多，王光志等[2]于2008年對藥物遠志進行了比較全面的本草考證，通過用藥歷史與名稱、品種的考證，發(fā)現(xiàn)雖然藥材品種較多，但遠志古今用藥品種基本一致，均為遠志P. tenuifolia Willd.與西伯利亞遠志P. sibirica L.。遠志最初來源于山東半島一帶，古代本草以山西、河南為道地，今以山西、陜西的質量最好，產量最大，為道地產地。由于市場近年來對遠志藥材的需求量劇增，導致野生資源遭到了極大破壞，遠志現(xiàn)已被列入國家重點保護的三級野生品種中[3]。中藥遠志研究主要集中在化學成分的分離鑒定和藥理作用方面，而關于遺傳多樣性的研究報道較少。

李佳等[4]曾對主產區(qū)遠志P. tenuifolia Willd.的種質資源遺傳多樣性進行了ISSR分析，包括野生種和栽培種，探索野生和栽培環(huán)境對遠志遺傳多樣性的影響。ISSR分子標記為第二代分子標記技術，克服了RAPD標記穩(wěn)定性和重復性差等缺點[5]，且ISSR標記多態(tài)性豐富，已被廣泛應用于品種鑒定、多樣性分析、指紋圖譜的構建等研究中[6]。

目前對藥用遠志的研究主要集中在遠志P.tenuifolia Willd.這個種，而對西伯利亞遠志的研究較少。本研究利用ISSR技術對西伯利亞遠志道地產地之一的山西省居群進行分析，從分子水平上探討其種質資源的遺傳多樣性和親緣關系，旨在為其種質資源的開發(fā)利用及遺傳育種研究提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

實驗材料分別采自山西省不同地區(qū)的8個居群，包括7個野生居群和1個人工栽培居群，居群代號見表1。經過云南大學馬海英副教授鑒定可知這8個居群均為西伯利亞遠志P. sibirica L.。其中太原市TZ居群10份種質；長治市CZT 和CZY居群各5份種質；寧武縣NWI和NWII居群各10份種質；太原古交市TG居群5份種質；運城市YC居群5份種質；呂梁市關帝山GDS居群10份種質等。共計60份種質，其地理信息見圖1。

1.1.2 儀器設備

紫外分光光度計；Biometra高性能PCR儀（德國Analytik Jena公司生產）；紫外凝膠成像儀等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測

參照Doyle等[7]的 CTAB法，稍作改良（加入CTAB前先加入去多糖Buffer去除多糖）。稱取0.03 g干燥的植物葉片進行DNA提取，用50 μL的0.1×TE溶液進行溶解，在1%的瓊脂糖凝膠電泳下檢測其完整性，用紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，用0.1×TE溶液稀釋至20 ng/μL后于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 引物篩選及PCR擴增檢測

根據加拿大大不列顛哥倫比亞大學（UBC）公布的100對ISSR引物序列進行引物合成，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。從8個居群中各選取2個樣品的DNA模板進行擴增篩選，其中有33條引物能擴增出條帶，對每條引物進行退火溫度篩選，其中條帶清晰、條數較多且重復性較好的引物共計20條（表1）。PCR擴增反應在德國Analytik Jena公司生產的Biometra 高性能PCR儀中進行。最終確定的反應體系為25 μL，包括20 ng/μL的DNA、10×buffer（含MgCl2）、2.5 mmol/L 的dNTPs、5 U/μL的Easy Taq DNA聚合酶，最后以去離子水補足至25 μL。PCR擴增程序為40個循環(huán)：95℃變性30 s；最適溫度（根據每條引物的理論退火溫度再進行梯度PCR確定，部分種質退火溫度見圖2和圖3）退火30 s；72℃延伸90 s；循環(huán)結束后以72℃延伸10 min。擴增產物經由0.5×TBE溶液配置的2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在90 V電壓下于冰面上電泳1.5 h，用EB（溴化乙錠）染色后將其置于紫外凝膠成像儀中觀察并保存圖像。

1.3 數據統(tǒng)計與分析

ISSR標記為一種顯性標記，圖譜中的每一條帶都視為1個分子標記，有清晰條帶者記為1，同一位置無帶者記為0，采用人工計數方法根據統(tǒng)計數據建立（0，1）矩陣。利用POPGENE 1.32軟件分析計算多種群遺傳多樣性和遺傳分化等指數，包括Nei's基因多樣性指數（H）、Shannon信息指數（I）、多態(tài)位點百分率（PPL）、有效等位基因數（Ne）、居群內基因多樣性（Hs）、居群間遺傳分化系數（Gst）、基因流（Nm）、Nei's基因遺傳距離等。應用GenAlEx6.41軟件對種群內和種群間進行AMOVA分析和主成分分析。利用NTSYS2.1聚類分析軟件進行UPGMA法聚類分析。

2 結果與分析

2.1 西伯利亞遠志的遺傳多樣性分析

實驗中共篩選出20條引物，擴增出338個位點，其中多態(tài)性位點達到334個。從表2可以看出，多態(tài)性位點百分率（PPL）為98.82%。絕大多數擴增片段大小在250～2 000 bp，部分電泳片段見圖4。8個居群中CZY居群多態(tài)性最高，其多態(tài)位點為243個，多態(tài)率為71.89%；多態(tài)性最低的為TG居群，其多態(tài)位點為38個，多態(tài)率為11.24%；栽培居群TZ的多態(tài)位點為163個，多態(tài)率為48.22%。用POPGENE1.32軟件分析得到的西伯利亞遠志的多樣性指數見表2，Shanoon's指數（I）為0.4142；Nei's遺傳多樣性（H）為0.265 6。通過多態(tài)性位點百分率（PPL）、遺傳多樣性（H）和Shanoon's指數（I）分析可知，8個居群中多態(tài)性高低依次為CZY>CZT>TZ>NWI>NWII>GDS>YC>TG。

2.2 西伯利亞遠志的遺傳結構分析

通過POPGENE 1.32軟件分析可知，西伯利亞遠志居群內基因多樣度（Ht）為0.275 9，基因多樣性（Hs）為0.1307，遺傳分化系數（Gst）為0.526 0，Nm為0.450 5。另外，通過利用GenAlex6.41軟件進行AMOVA分析（P=0.010）可知，居群間遺傳變異占45%，居群內遺傳變異占55%（表3）。

利用POPGENE 1.32軟件運算8個居群中NWI和NWII居群的遺傳距離最近為0.022 4，CZT和TG居群的遺傳距離最遠為0.422 8（表4）。不同居群的遺傳相似度（即遺傳一致度）在0.655 2～0.977 9，平均值為0.806 2。

2.3 西伯利亞遠志的聚類分析

用GenAlex6.41軟件構建歐式平方距離，在此基礎上對8個居群進行主成分分析，以此檢測居群的遺傳相似性（圖5）。主成分分析可排除重疊和分類意義不大的條帶，使重要因素突顯出來。主成分分析結果表明，長治的2個野生居群CZY和CZT聚為一類；寧武的2個野生居群NWI和 NWII以及太原的栽培居群TZ聚為一類；太原古交的居群TG、運城YC居群和呂梁GDS居群聚為一類。

再利用 NTSYS2.1聚類分析軟件進行UPGMA法聚類分析，建立聚類分支樹狀圖（圖6）。 8個居群種質在0.823和0.876處共分為3類，CZY和CZT居群為一類；NWI、 NWII和TZ居群為一類； GDS、TG和YC居群為一類。其中CZY和CZT居群與其他居群距離最遠，聚類分析結果與主成分分析結果基本相同。

3 討論與結論

3.1 西伯利亞遠志的遺傳多樣性

本研究結果顯示，山西省西伯利亞遠志居群具有豐富的遺傳多樣性（H=0.265 6，I=0.414 2，PPL=98.82%）。遺傳多樣性是生物在長期進化和生長過程中所形成的自然屬性，受多方面因素的影響，如生殖方式、生活型、分布范圍、花粉、種子傳播方式以及演化歷史等[8]。一個物種的遺傳多樣性與其生活史特征和生態(tài)特征密切相關，分布范圍廣泛是物種遺傳多樣性高的主要因素；其次物種繁殖方式對其影響也較大[9-10]，相關學者普遍認為多年生廣布種、異交和以種子為傳播方式等均會使植物具有較高的遺傳多樣性。

西伯利亞遠志在中國均有分布，此外還分布于歐洲、俄羅斯西伯利亞、尼泊爾、印度、蒙古和朝鮮等地[11]，分布范圍廣泛。西伯利亞遠志為多年生草本，花粉形態(tài)和雌雄蕊位置都表現(xiàn)出明顯的蟲煤傳粉特征，且自交不育[12]，這些特征都導致其具有較高的遺傳多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)，栽培種居群TZ遺傳多樣性亦較高（H=0.151 4，I=0.230 9，PPL=48.22%），是因為此栽培種是由直接采自野生居群的種子繁育而成的，人工露地種植環(huán)境相當于半野生狀態(tài)。

3.2 西伯利亞遠志的遺傳分化

西伯利亞遠志居群的Gst為0.526 0，表明居群間遺傳變異為52.60%；AMOVA分析結果表明，居群間的遺傳變異為45%。2種方法分析結果雖然有所差異，但都表明西伯利亞遠志種質居群間出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化。分析認為主要是由于基因流降低而造成的，基因流是影響群體間遺傳分化的主要因素[13]。本研究中西伯利亞遠志的基因流（Nm）為0.450 5，當居群的基因流小于1時，表示遺傳漂變導致了居群間的遺傳分化[14]。分析認為，西伯利亞遠志基因流較低的原因是野生居群生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞導致的。西伯利亞遠志本身生長周期長、產量低、生長分散，近年來的過度采挖造成其生長環(huán)境的嚴重破壞，其密度和再生能力明顯減弱，進而使生境片段化，導致野生居群整體基因流降低，造成了居群間遺傳分化的加劇。

根據聚類分析和主成分分析結果將西伯利亞遠志居群分為3類，這與各居群間的地理距離有一定關系。其中太原市的栽培居群TZ和寧武縣的2個野生居群NWI和NWII聚為一類，表現(xiàn)出較大的地域分布差異性，TZ居群是由野生居群引種栽培而來的，這可能是其聚類結果與其地理原產地之間沒有相關性的主要原因。國外學者Thimmappaiah等[15]對栽培植物腰果（Anacardium occidentale）的研究也證實了這一點，發(fā)現(xiàn)產生這一結果的主要原因是來自不同地方的種質已經進行了基因的自由交流。

3.3 西伯利亞遠志的保育策略

山西省為西伯利亞遠志的道地產地之一，其與陜西的總產量占全國70%以上[16]。但如今野生西伯利亞遠志資源已經難以滿足市場需求，資源逐年銳減，有些地方甚至已經瀕臨滅絕。而人工栽培種子來源復雜，加上其生長周期較長，對栽培技術要求高，難以形成規(guī)?；耘?，不能滿足市場需求[17]。

野生西伯利亞遠志資源具有豐富的遺傳變異，是培育優(yōu)良品種的遺傳物質基礎?？蓪σ吧Y源進行就地保護和采集種源，用以建立種質資源圃，通過育種方式形成栽培品種，篩選出適應不同生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良品種，以此逐步替代野生資源，當條件成熟時也可對野生資源進行恢復和重建。同時提高人工栽培技術水平，建立一套完善優(yōu)質的遠志栽培技術體系，實現(xiàn)西伯利亞遠志資源的可持續(xù)利用。

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