劉師文，徐 剛，施 勇，龔 甜，李健雄，劉曉慶，熊 英

江西省漢坦病毒分離及其S和M基因特征分析

劉師文，徐 剛，施 勇，龔 甜，李健雄，劉曉慶，熊 英

目的 對2011年江西省采集的鼠肺標本進行漢坦病毒的分離鑒定，了解分離病毒株的基因特征。方法 采用Vero-E6細胞對陽性鼠肺標本進行病毒分離，采用直接免疫熒光法和RT-PCR方法對毒株進行鑒定。擴增分離株的S、M片段基因進行克隆測序。運用DNAstar軟件包和MEGA3.1軟件對序列進行分析。結(jié)果 從15份標本分離到2株來自褐家鼠的漢城型漢坦病毒。對其中1株病毒的S、M片段進行了克隆和序列測定，其中S片段含1 772個核苷酸，編碼429個氨基酸；M片段含3 651個核苷酸，編碼1 133個氨基酸。經(jīng)核苷酸和氨基酸同源性分析，新分離株與國內(nèi)外漢城型病毒核苷酸同源性94.8 %～98.0%，氨基酸同源性98.2%～99.6%。與漢城型標準株80-39株相比，S片段僅1個氨基酸位點發(fā)生變異；M片段有9個氨基酸位點發(fā)生變異，糖基化位點的數(shù)目和位置沒有發(fā)生變化。結(jié)論 從江西省褐家鼠分離到兩株漢城型病毒，病毒基因變異較小，型別相對穩(wěn)定。

漢坦病毒；病毒分離；M基因；S基因；序列分析

Support by the Provincial Health Department of Jiangxi Province (No. 20123156)

漢坦病毒(Hantavirus，HV)屬布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantavirus)，是有包膜的負鏈 RNA 病毒。HV基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個基因片段組成。目前已經(jīng)有40多個血清型或者基因型，并且至少有22個型的HV能引起人類疾病[1-2]。

鼠類等嚙齒動物是HV的自然儲存宿主，人類主要通過吸入受感染動物的分泌物或排泄物而獲得病毒感染。在世界上很多國家，鼠源的HV感染導致的人類腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)或漢坦病毒肺綜合癥是非常重要的人獸共患病。中國是HFRS流行最嚴重的國家之一， 發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)在全世界最多[3-4]。

目前國內(nèi)外已分離到很多HV，江西地區(qū)早在20世紀80年代就由劉佩琴等人分別從社鼠和羅賽鼠中分離到HV C94株和 L99株[5]。L99株曾作為疫苗株制備腎綜合征出血熱地鼠腎滅活疫苗[6]。之后再未見江西地區(qū)分離到HV的報道，關(guān)于HV的檢測一直停留在免疫檢測水平。本研究對2011年采集的HV陽性鼠肺標本進行病毒分離，并對分離株進行了S和M片段基因測序分析，以了解我省HV的基因特征和遺傳變異情況，為HFRS的防控提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標本來源 于2011年春秋季，在江西省高安、安義、新建、上饒、上高和浮梁縣(市)捕鼠，共捕獲鼠類616只鼠，對鼠肺進行了直接免疫熒光HV抗原檢測，從41份HV陽性鼠肺中選取15份保存較好的鼠肺標本進行病毒分離。

1.2 主要試劑和材料 Vero-E6細胞來自中國疾病預防控制中心病毒病所出血熱室，熒光素標記的漢坦病毒抗體、(第四軍醫(yī)大學)、小牛血清(杭州四季青)、胎牛血清(GIBCO)、MEM(GIBCO)、Rneasy Mini Kit (Qiagen)、SuperScript?Ш First-Strand synthesis system for RT-PCR(Invitrogen)、2 000 bp DNA Marker、Pyrobest?DNA Polymerase(TaKaRa)、聚合酶鏈反應(PCR)相關(guān)試劑(Promega)和細胞刮刀(Corning)。

1.3 病毒分離 將HV陽性的鼠肺標本經(jīng)液氮研磨后用MEM溶液(含1%青霉素和鏈霉素，pH7.4)制成10%懸液，3 000 g離心10 min，取1 mL上清接種于Vero-E6細胞，37 ℃孵育2 h；吸去殘留液體加入2%牛血清的維持液，37 ℃培養(yǎng)。每3～4 d換1次維持液，28 d傳代1次。分別在每代第7、14、21、28 d用細胞刮刀刮取少量細胞涂片進行直接免疫熒光檢測。連續(xù)傳代3次仍為HV陰性者，則放棄培養(yǎng)。

1.4 培養(yǎng)物的直接免疫熒光檢測 用細胞刮刀刮取少量細胞至載玻片，在生物安全柜干燥，冷丙酮固定20 min，PBS沖洗2次，蒸餾水漂洗1次，吹干，加熒光素標記漢坦病毒抗體，置濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min取出， PBS沖洗3次，蒸餾水漂洗1次，吹干，甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 核酸提取、擴增、克隆和測序 對出現(xiàn)免疫熒光陽性結(jié)果的培養(yǎng)物，采用德國QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取，具體步驟參照產(chǎn)品說明書。引物見表1，逆轉(zhuǎn)錄及漢坦病毒鑒定引物和方法參照2004版《全國腎綜合征出血熱監(jiān)測方案(試行)》。采用P14引物及SuperScript?Ш First-Strand synthesis system for RT-PCR試劑盒合成cDNA， 反應體系和反應條件參照試劑盒說明書。S片段采用1對引物，M片段采用2對引物擴增，PCR反應條件：95 ℃ 變性5 min；94 ℃ 1 min， 54 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min，共擴增40個循環(huán)，72 ℃延伸 20 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，目的片段擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行克隆并測序。

表1 漢坦病毒逆轉(zhuǎn)錄及擴增引物

1.6 基因序列分析 運用DNAStar 軟件(SeqMan)對測定的序列進行拼接，得到S和M片段基因的核苷酸序列，并推導出相應的氨基酸序列。選擇GenBank公布的國內(nèi)外HV代表株基因序列用于比較分析，運用MEGA3.1和DNAstar軟件包進行系統(tǒng)發(fā)生分析。參考毒株信息見表2。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離 從江西省新建縣的褐家鼠中分離到2株HV，命名為JiangxiXinjianRn-07-2011和JiangxiXinjianRn-09-2011。對培養(yǎng)物進行直接免疫熒光實驗，這兩份標本均在第1代第21 d開始出現(xiàn)特異性的熒光顆粒，第2代第7 d，所有細胞帶特異的熒光顆粒。而其他培養(yǎng)物培養(yǎng)3代都沒有出現(xiàn)特異性熒光顆粒。

表2 參考毒株的來源信息

2.2 病毒鑒定 采用HV特異性引物(HV-MG2F、HV-MG2R)擴增新分離兩株病毒，均獲得一個445 bp (1 910～2 354 bp) 目的片段?；贛片段300個核苷酸序列(2 003～2 302 bp)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹見圖1。這2株病毒均分布在漢城型病毒(SEOV)分支并由此得出這兩株病毒均為SEOV型HV。

2.3 S和M片段核酸擴增 選擇JiangxiXinjianRn-09-2011株進行S和M基因片段擴增(圖1)，一條S目的片段大小1.7 kb， M片段分兩段擴增，目的片段大小分別為2.2 kb和1.7 kb，與預期結(jié)果相符。

圖1 HV部分M片段核苷酸系統(tǒng)發(fā)生樹(2 003～2 302 bp)

Fig.1 Phylogenetic tree of HV based on partial M segment (2 003-2 302 bp)

M: Marker; 1: PCR products of S segment; 2: PCR products of M1; 3: PCR products of M2.

圖2 JiangxiXinjianRn-09-2011病毒株S、M片段擴增電泳圖

Fig.2 Electrophoresis patterns of complete S, M segments PCR products of JiangxiXinjianRn-09-2011 using the specific primers

2.4 S和M片段核苷酸序列分析 JiangxiXinjianRn-09-2011病毒株S片段基因序列(GenBank登陸號為KP859512)為1 772 bp，其中 A、T、C、G的比例分別為31.60%、26.41%、18.91%、23.08%，A+T含量58.01%，C+G含量為41.99%。JiangxiXinjianRn-09-2011的S片段核苷酸與GenBank公布的14株SEOV核苷酸同源性達95.7%～98.0%，與SEOV國際標準株80-39株的同源性為97%；與WuhanRf02株同源性為98.0%；與GOU3株同源性為88.2%，與漢灘型(HTNV)、多不拉伐型(DOBV)等其他型別的HV同源性均低于75%。

JiangxiXinjianRn-09-2011病毒株的M片段基因序列(GenBank登陸號為KP859514)為3 651個核苷酸，其中A、T、C、G的比例分別為30.65%、30.35%、18.49%、20.51%，A+T含量61.00%，C+G含量為39.00%。M片段核苷酸與GenBank公布的8株SEOV核苷酸同源性94.8%～96.1%，與朝鮮分離株DPRK08同源性最高為96.1%，與80-39株同源性為95.5%；與GOU3株核苷酸同源性為84.6%，與HTNV型同源性為71.1%～71.3%，與其他型別HV核苷酸同源性均低于70%。

運用MEGA3.1和DNAStar軟件，以鄰位相連法(Neighbor-Joining)分別構(gòu)建S和M片段核苷酸系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3和圖4)，JiangxiXinjianRn-09-2011株分布在SEOV分支。圖3還顯示JiangxiXinjianRn-09-2011與WuhanRf02株親緣關(guān)系最近。

2.5 氨基酸序列分析 JiangxiXinjianRn-09-2011株S基因片段只存在1個開放閱讀框(43～1 332 nt)，編碼429個氨基酸， 5′端和3′末端分別含43個和440個核苷酸的非編碼區(qū)。其編碼的氨基酸序列與SEOV氨基酸同源性98.2%～99.8%，國際標準株80-39株同源性為99.8%，僅第186位的氨基酸發(fā)生變異，變異率為0.23%；與江西地區(qū)分離的疫苗株L99株氨基酸同源性99.3%， 氨基酸變化情況為T43A、S186F、A288S。與HTNV型76-118株的氨基酸同源性為84.4%，與其他型別HV氨基酸同源性均低于85%。

圖3 S片段核苷酸系統(tǒng)發(fā)生分析

圖4 M片段核苷酸系統(tǒng)發(fā)生分析

JiangxiXinjianRn-09-2011株M基因片段只存在1個開放閱讀框(47～3 448 nt)，編碼1 133個氨基酸，5′端和3′末端分別含46個和203個核苷酸的非編碼區(qū)。其編碼的氨基酸序列與SEOV同源性98.7%～99.6%，與HTNV 76-118株的同源性為77.8%，與其他型別HV氨基酸同源性更低。

氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，G1區(qū)末端存在保守氨基酸序列642WAASA647，是前體蛋白的裂解信號。G1區(qū)存在5個潛在的天門冬酰氨糖基化位點，分別為第132、233、345、397、560位，G2區(qū)926位存在1個潛在糖基化位點。與80-39株、L99株比較，M片段糖基化位點的數(shù)目和位置沒有發(fā)生變化。G1區(qū)含34個半胱氨酸，G2區(qū)含28個半胱氨酸，同80-39株、L99株相比增加了一個半胱氨酸。與標準株80-39株相比JiangxiXinjianRn-09-2011 M片段氨基酸共有9個氨基酸位點發(fā)生了變化，變異率為0.79%，氨基酸的變化情況詳見表3。

表3 M片段氨基酸變化情況

注：JXR09 代表毒株JiangxiXinjianRn-09-2011

Note : "JXR09" is JiangxiXinjianRn-09-2011.

3 討 論

病毒分離對病毒性傳染病的研究至關(guān)重要，獲得病毒株就能全面系統(tǒng)的進行研究，且有較好的重復性和可信度，還能為疫苗的研制打下基礎。本研究在2011年對江西省6個縣區(qū)開展了HV的分子流行病學調(diào)查，共采集了616份鼠肺標本，其中41份通過直接免疫熒光法檢測到HV抗原。隨著愛國衛(wèi)生運動開展滅鼠，捕鼠的工作難度也加大，捕鼠時間過長，現(xiàn)場解剖不及時，基層冷凍保存的條件有限等原因，導致我們收到標本時大部分的標本已經(jīng)發(fā)黑甚至腐爛。我們選取了15份較新鮮和份量較多的HV陽性鼠肺標本進行了病毒分離，最終成功分離出2株HV，通過S和M片段序列分析表明，這兩株病毒同為SEOV。這兩株病毒均來自新建縣的褐家鼠(該縣共4份標本用于病毒分離)。分析原因，新建縣的采樣點離本實驗室最近，標本采集當天立即送往實驗室放入-70 ℃保存，由此我們認為標本的采集保存和運輸過程對HV的病毒分離率存在很大的影響。為了保證原始標本質(zhì)量，提高病毒分離率，最好能攜帶液氮罐到基層采樣，及時將采集標本置液氮保存。

HV基因組L、M、S 3個基因片段分別編碼 RNA 依賴的 RNA 聚合酶、糖蛋白(GP)Gn 和 Gc 的前體糖蛋白及核衣殼蛋白(NP)。在HV 3個片段中M片段的重組率較高，可能與M基因編碼的糖蛋白承受來自HV宿主免疫壓力最大有關(guān)[10]；L片段最保守，這可能是L片段編碼蛋白功能的保守性需要所致[11]。自從1984年江西分離到L99和C94株HV以后，時隔30年再次分離到HV，因此為了解現(xiàn)今分離毒株基因特點和遺傳變異情況，我們選擇S和M片段進行基因序列分析。

JiangxiXinjianRn-09-2011與國內(nèi)外其他SEOV核苷酸同源性為94.8%～98.0%，但氨基酸的同源性在98%以上。與 L99株S片段核苷酸同源性為95.7%，氨基酸同源性為99.3%；M片段核苷酸和氨基酸同源性分別為95.2%、98.7%，說明年代對SEOV的基因變化影響不大；JiangxiXinjianRn-09-2011與國際標準株80-39株的S片段只發(fā)生一個氨基酸位點變異，變異率0.23%；M片段有9個氨基酸位點變異，變異率為0.79%，但糖基化位點的數(shù)目和位置沒有發(fā)生變化。結(jié)果表明褐家鼠攜帶的SEOV基因變異較小，相對穩(wěn)定。 這也為疫苗保護效果和HFRS防控提供了有利的分子生物學依據(jù)。

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Hantavirus isolation and the complete S, M segments genetic analysis of the isolates in Jiangxi Province, China

LIU Shi-wen,XU Gang,SHI Yong,GONG Tian,LI Jian-xiong,LIU Xiao-qing,XIONG Ying

(JiangxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

We isolated Hantavirus from the rodents' lung samples in order to know the genetic characteristic of new isolates in Jiangxi Province. Samples were collected in 2011, and Hantavirus was isolated through Vero-E6 cells culture, the strains were identified by direct immunofluorescence assay and RT-PCR. The complete S, M segments of one strain were amplified and sequenced, the gene sequences were analyzed with DNAStar and MEGA3.1 software. Two Seoul viruses (SEOV) were isolated and identified from 15 samples. The complete S segment contained 1 772 nucleotides with a single open reading frame coding 429 amino acids; M segment contained 3 651 nucleotides in length with a single open reading frame coding 1 133 amino acids. The similarities to other SEOVs based on S/M nucleotides and amino acid sequences were 94.8%-98.0% and 98.2%-99.6% respectively. Compared to 80-39 strain, there was only one amino acid site changed in the S amino acid sequence and 9 amino acid sites changed in the M amino acid sequence. Results showed that comparing to other SEOVs the genes of new isolates are highly conserved.

Hantavirus; virus isolation; M and S segments; sequence analysis

Xiong Ying, Email: xiongying8300087@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.014

熊英，Email：xiongying8300087@hotmail.com

江西省疾病預防控制中心，南昌 330029

373R

A

1002-2694(2015)12-1157-05

2015-02-28；

2015-06-12

江西省衛(wèi)生廳科技計劃項目(No. 20123156)