王偉楠，孫光偉，隋殿軍

(長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長春130117)

?

蜂膠總黃酮滴丸的高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析研究

王偉楠，孫光偉，隋殿軍*

(長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長春130117)

目的 闡明蜂膠總黃酮滴丸的主要化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。方法 利用高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蜂膠總黃酮滴丸進(jìn)行檢測，通過對照品、分子量和質(zhì)譜裂解規(guī)律對未知成分進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果 經(jīng)過分析，確定蜂膠總黃酮滴丸的主要化學(xué)成分為：山奈酚、喬松素、3-O-乙酰基短松素、白楊素和高良姜素。結(jié)論 利用高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以高效準(zhǔn)確的在未知提取物中確認(rèn)主要的化學(xué)成分，可以作為蜂膠總黃酮滴丸質(zhì)量控制的有力手段。

蜂膠；總黃酮；高分辨液質(zhì)聯(lián)用；質(zhì)量控制

蜂膠是一種珍貴的蜂產(chǎn)品，資源極為稀少，被譽(yù)為“紫色黃金”，其主要活性物質(zhì)為總黃酮類化合物[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實驗表明[3-6]，蜂膠總黃酮具有降壓、止痛、舒張血管等作用，是非常重要的活性天然產(chǎn)物。蜂膠總黃酮滴丸是由蜂膠總黃酮制成的中藥五類新藥，對于冠心病、心絞痛具有較好的療效[7-9]。然而其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，傳統(tǒng)的高效液相方法在未知成分鑒定方面存在一定的局限性[10-11]。因此，本文利用高效液相-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-HRMS)對蜂膠總黃酮滴丸進(jìn)行系統(tǒng)的成分分析，通過對照品、分子量和質(zhì)譜裂解規(guī)律對未知成分進(jìn)行指認(rèn)，為蜂膠總黃酮滴丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實驗材料

蜂膠購自安國藥材市場，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為蜂膠(Colla Apis.)。對照品山奈酚(110861-201310)、喬松素(111829-201102)、白楊素(111701-200501)、高良姜素(111699-200602)均購自中國食品藥品檢定研究院。高效液相用甲醇為色譜純(Thermo scientific)，甲酸為質(zhì)譜純(Sigma)，其他化學(xué)試劑均為分析純(北京化工廠)。Agilent 1260高效液相 (Agilent Technologies, USA)、Agilent 6520 Q-TOF 質(zhì)譜儀(Agilent Technologies, USA)；超純水機(jī)(Millipore, USA)；十萬分之一分析天平(METTLER TOLEDO，USA)；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(EYELA, Japan)真空干燥箱(上海一恒實驗儀器總廠)；FW177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰特儀器有限公司)；藥典篩(浙江上虞市五四儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 蜂膠總黃酮滴丸制劑工藝 蜂膠藥材在4 ℃冷凍一段時間后，粉碎，加10倍量75%的乙醇回流提取2次，合并提取液，過濾；續(xù)濾液經(jīng)減壓濃縮后，在真空干燥箱中80 ℃烘干，得到蜂膠粗提物；取一定重量的粗提物，加100倍量氯仿：甲醇(10∶1)涅溶，用等體積1%的NaOH水溶液萃取2次，收集水層，用1%HCl溶液調(diào)節(jié)pH值=6，室溫靜置24 h，離心，收集沉淀，干燥，即得蜂膠總黃酮。

稱取聚乙二醇6000 25 g，加熱熔化，加入蜂膠總黃酮細(xì)粉，攪拌混勻，傾入保溫管中，調(diào)節(jié)恒溫裝置，使藥液在(95±1) ℃下滴入冷卻過的甲基硅油中〔溫度(10±1) ℃〕，將藥丸傾入濾紙上，吸干甲基硅油，加入少量滑石粉，混勻，即得蜂膠總黃酮滴丸。

2.2 供試品溶液制備 取蜂膠總黃酮滴丸1 g，干燥、粉碎、精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm濾膜過濾，備用。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱定山奈酚、喬松素、高良姜素、白楊素對照品適量，用甲醇溶解稀釋成每1 mL含單體化合物各2 μmol/L的溶液，即為對照品溶液。

2.4 分析條件的選擇

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-AQ (4.6×250 mm，4.5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量:10 μL；流動相A為0.1%甲酸/甲醇，B為0.1%甲酸/水，洗脫條件如下：0～110 min(35%～90% A)，110～120 min(90%A)。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；電離模式：Positive；噴霧器壓力：30 psi；干燥氣(N2)流速：9 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3 500 V；碎裂電壓：175 V；錐孔電壓：65 V；質(zhì)量檢測范圍(m/z)：100-1200；數(shù)據(jù)分析軟件：Agilent MassHunter Workstation software-Qualitative Analysis (version B.04.00, Build 4.0.479.5, Service Pack 3, Agilent Technologies, Inc. 2011)。

3 結(jié)果

通過HPLC-MS分析，我們發(fā)現(xiàn)蜂膠總黃酮滴丸的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)中主要包括5個含量較高的單體化合物。這5個化合物在本實驗所采用的色譜條件下分離度較好，對于定性分析沒有明顯的干擾，利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件MassHunter Workstation software進(jìn)行分子式計算，發(fā)現(xiàn)色譜峰1、2、4、5分別與已有文獻(xiàn)報道的蜂膠中主要黃酮類物質(zhì)山奈酚、喬松素、白楊素和高良姜素的分子式吻合，進(jìn)一步通過標(biāo)準(zhǔn)品對照可以確定，色譜峰1為山奈酚，色譜峰2為喬松素，色譜峰4為白楊素，色譜峰5為高良姜素。實驗結(jié)果見圖1。

圖1 供試品和對照品的質(zhì)譜圖

色譜峰3的分子量為315.1084，計算分子式為C16H14O5，其分子量和色譜行為與黃酮類化合物相似；通過進(jìn)一步加大質(zhì)譜碎裂電壓，觀察色譜峰3的碎片離子，構(gòu)建了[M+H]+ m/z 315→273→255→227的碎裂規(guī)律。通過查閱大量蜂膠及黃酮類化合物液質(zhì)聯(lián)用分析的文獻(xiàn)[12-17]，確定該化合物的分子量、分子式以及質(zhì)譜裂解規(guī)律與3-O-乙酰基短葉松素一致，因此，確定色譜峰3為3-O-乙?；倘~松素。實驗結(jié)果見圖2、表1。

4 討論

雖然目前在市場上有很多與蜂膠相關(guān)的健康產(chǎn)品，但產(chǎn)品的質(zhì)量和開發(fā)程度參差不齊；絕大多數(shù)的產(chǎn)品僅僅是將蜂膠粗加工后簡單包裝以食品的形式出售，還有一些是將蜂膠中提取的活性成分開發(fā)成寶健食品或中藥五類新藥，蜂膠總黃酮滴丸就是這類產(chǎn)品的典型代表。本實驗通過高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蜂膠總黃酮滴丸的成分進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，從中指認(rèn)出5個含量最高的黃酮類化合物，填補(bǔ)了蜂膠總黃酮滴丸物質(zhì)基礎(chǔ)研究的空白，為蜂膠總黃酮滴丸的作用機(jī)理研究和臨床安全使用奠定了基礎(chǔ)。

圖2 色譜峰3的質(zhì)譜裂解規(guī)律

表1 色譜峰指認(rèn)

色譜峰編號保留時間m/z[M+H]+MSn[M+H]+計算分子式定性鑒別141．355287．0810165，153，121C15H10O6山奈酚247．403257．0854215，153，131C15H12O4喬松素352．508315．1084273，255，000C16H14O53?O?乙?；倘~松素459．359255．0745209，153，129C15H10O4白楊素555．566271．0691165，153，105C15H10O5高良姜素

[1]周志龍.天然的綠色藥品--蜂膠的醫(yī)療價值[J].吉林中醫(yī)藥,2003,23(5):51.

[2]徐響,張紅城,董捷.蜂膠功效成分研究進(jìn)展[J ] 食品工業(yè)科技,2008,29(9):286- 289.

[3]王元元,黃云英,杜娟,等.蜂蜜、蜂膠對深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面愈合的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,31(3):154-156.

[4]王啟海,梁楓,侯晞,等.蜂膠總黃酮對全腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護(hù)作用[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,30(6):967-970.

[5]胡福良,玄紅專.蜂膠的生物學(xué)活性及毒性和過敏反應(yīng)[J].科技通報,2003,19(2):166-169.

[6]何曉波,周俐斐,蘆柏震.蜂膠的藥理活性[J].中國藥業(yè),2006,15(1):27-28.

[7]郭金昊,楊傳華,王靜,等.蜂膠總黃酮滴丸治療慢性穩(wěn)定性心絞痛氣虛血瘀證療效及安全性研究[J].吉林中醫(yī)藥,2015,35(9):893-896.

[8]許妍妍,張煜.蜂膠與冠心病心絞痛[J ] 吉林醫(yī)學(xué),2009,30(3):273-275.

[9]隋殿軍.蜂膠總黃酮滴丸治療心血管疾病的藥效學(xué)及毒理學(xué)研究[C].//2009年傳統(tǒng)醫(yī)藥國際科技大會論文集,2009:278-283.

[10]張翠平,胡福良.蜂膠中類黃酮化合物分析方法的研究進(jìn)展[J].蜜蜂雜志,2010,30(3): 3-7.

[11]張翠平,柳剛,胡福良.液質(zhì)聯(lián)用在蜂膠質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用[J].中國蜂業(yè)中旬刊(學(xué)術(shù)),2012(1):90-93,96.

[12]VOLPI N, BERGONZINI G. Analysis of flavonoids from propolis by on-line HPLC-electrospray mass spectrometry [J]. J Pharm Biomed Anal, 2006,42(3): 354-361.

[13]PELLATI F, ORLANDINI G, PINETTI D, et al. HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS/MS methods for metabolite profiling of propolis extracts [J]. J Pharm Biomed Anal, 2011, 55(5):934-948.

[14]MIDORIKAWA K, BANSKOTA A H, TEZUKA Y, et al. Liquid chromatography-Mass spectrometry analysis of Propolis [J]. Phytochem Anal, 2001,12(6): 366-373.

[15]SORAIA I F, MIGUEL V B, LETICIA M E, et al. Phenolic characterization of northeast Portuguese propolis: usual and unusual compounds [J]. Anal Bioanal Chem, 2010, 396(2):887-897.

[16]賈艾玲,鄭愛竹,王睿,等.不同地區(qū)蜂膠原料藥的質(zhì)量評價[J].遼寧中醫(yī)雜志,2014, 41(2): 316-318.

[17]韓紅祥,王維,陳雪松,等.應(yīng)用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)研究不同基源蜂膠指紋圖譜[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(12):1221-1223.

HPLC-HRMS analysis of propolis total flavonoids dripping pills

WANG Weinan，SUN Guangwei，SUI Dianjun*

(Changchun University of Chinese Medicine, Jilin Changchun 130117)

Objective To elucidate the chemical basis for propolis total flavonoids dripping pills (PTFDP). Methods PTFDP were detected via HPLC-HRMS while determining unknown compounds through reference compounds, molecular weight and MS fragmentation rules. Results After analysis, the major components of PTFDP were determined to be kaempferol, pinocembrin, pinobanksin-3-O-acetate, galangin and chrysin. Conclusion HPLC-HRMS was proved to be effective and accurate in the characterization of main chemical components in unknown extracts. Hence this technology would be a promising strategy for the quality control of PTFDP.

propolis; total flavonoids; HPLC-HRMS; quality control

10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.12.026

國家自然科學(xué)基金項目(81173543)。

王偉楠(1985-)，男，博士研究生，講師。主要從事中藥化學(xué)研究。

R284.1

A

1003-5699(2015)12-1272-03

趙玉芝

2015-11-27)

*通信作者:隋殿軍，教授，博士研究生導(dǎo)師，電子信箱-cnweinanwang@163.com