李江等

摘 要 螺蟲乙酯作為一種結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特和廣譜高效的季酮酸類衍生物殺蟲殺螨劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍應(yīng)用，隨著用量的增加，對水生生物會造成一定的影響。采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）方法在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)螺蟲乙酯2.5、2.97、3.54、4.20、5.00 mg/L 5個(gè)濃度梯度，研究其對斑馬魚的急性毒性，采用酚-氯仿萃取的方法提取DNA，并進(jìn)行了優(yōu)化，用DNA Ladder方法觀察其細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，用Giemsa染色觀察其外周血細(xì)胞微核率，初步探索其致毒機(jī)制。結(jié)果表明，螺蟲乙酯對斑馬魚72 h的LC50值為5.898 mg/L、96 h的LC50值為3.642 mg/L，屬中等毒性；各濃度梯度螺蟲乙酯藥劑處理后的斑馬魚DNA出現(xiàn)梯狀條帶，螺蟲乙酯染毒后對斑馬魚造成一定程度上的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；處理組微核率為（7.250±1.893）～（5.500±0.577），與對照組和溶劑組差異均達(dá)顯著水平。

關(guān)鍵詞 螺蟲乙酯 ；斑馬魚 ；急性毒理 ；基因組DNA ；細(xì)胞凋亡 ；微核

分類號 S767

Abstract Spirotetramat is a insecticide matricide which has a novel structure and unique mechanism of action and also has broad spectrum keto derivatives. It is widely used in agricultural production which may cause some affected on aquatic organisms with the increasing amount of spirotetramat.We adopted the method of OECD （Organization for Economic Co-operation and Development） and set 5 concentrationgradients of spirotetramat like 2.5，2.97，3.54，4.20，5.00 mg/L to study its acute toxicity on zebra fishes. To preliminarily explore its toxic mechanism， we used phenol-chloroform extraction method to extract DNA which had been optimized， observed the phenomenon of apoptosis by DNA Ladder method and used Giemsa staining micronucleus frequency in peripheral blood cells. Spirotetramated zebra fish 72 h LC50 value is 5.898 mg/L and 96 h LC50 value is 3.642 mg/L. The results show that Spirotetramat is moderately toxic and occured apoptosis phenomenon to some extent on the zebra fish. After each zebrafish DNA concentration gradient Spirotetramat pharmaceutical treatment appeared ladder. Treated micronuclei was （7.250±1.893）～（5.500±0.577）. Compared with control group and solvent group， the differences were reached significant levels.

Keywords spirotetramat ； zebra fish ； acute toxicity ； genomic DNA ； apoptosis ； micronucleus

螺蟲乙酯（spirotetramat）是2008年由拜耳作物科學(xué)公司開發(fā)的一種季酮酸類衍生物殺蟲殺螨劑，原藥屬低毒，原藥大鼠急性經(jīng)口LD50>2 000 mg/kg。大鼠急性經(jīng)皮LD50>2 000 mg/kg。大鼠吸入LC50>4 183 mg/m3[1]，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一雙向性內(nèi)吸性殺蟲劑[2]。2008年在美國、加拿大、奧地利、新西蘭、摩洛哥、土耳其和突尼斯登記，2009年在巴西、南非、荷蘭、墨西哥獲得登記，2011年3月在中國登記[2]。螺蟲乙酯作用機(jī)制是通過抑制昆蟲體內(nèi)乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）活性，從而干擾脂肪的生物合成。目前國內(nèi)對螺蟲乙酯的研究主要集中在合成工藝、開發(fā)[2-3]、藥效及毒性效應(yīng)等方面。研究顯示，螺蟲乙酯對介殼蟲[4]、煙粉虱[5]和蚜蟲[6]等刺吸式口器害蟲有一定的防治效果。

研究發(fā)現(xiàn)螺蟲乙酯能使非洲鯰魚胚胎發(fā)育遲緩，并且干擾幼魚的游動平衡以及對雌性斑馬魚有一定的毒性和氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此本文研究螺蟲乙酯對斑馬魚的急性毒性以及細(xì)胞凋亡的影響，旨在探索螺蟲乙酯對水生生物的毒性效應(yīng)。文中細(xì)胞凋亡采用了DNA ladering 的方法，關(guān)于斑馬魚DNA提取方法的相關(guān)研究有劉臻等[8]利用試劑盒法和酚一氯仿法提取鯽魚基因組DNA，并對比分析了2種方法的提取效果。S.Roques等[9]利用酚-氯仿法提取北大西洋深水雄鮭肌肉組織基因組DNA，并進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。目前，尚未見針對螺蟲乙酯對斑馬魚細(xì)胞凋亡研究的相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試生物

野生AB型斑馬魚（AB-Line）由國家斑馬魚中心引進(jìn)，為實(shí)驗(yàn)室條件封閉體系中自行繁殖的F2代。試驗(yàn)用幼魚體長（2±1）㎝、體重（0.4±0.1）g的；馴養(yǎng)條件為水溫（25±1）℃，光照與黑暗周期為14 h/10 h，每天早9：00，晚19：00各喂食1次，自然死亡率<1%。試驗(yàn)前24 h停止喂食，試驗(yàn)期間不喂食。在成魚中挑選魚鰭完整、體色光亮、行動活潑、逆水性強(qiáng)、大小無太大懸殊且無任何疾病的魚作為試驗(yàn)用魚。以免除了藥物以外其他外在因素對試驗(yàn)造成影響。

1.1.2 稀釋水

試驗(yàn)用水及水質(zhì)條件：整個(gè)試驗(yàn)飼養(yǎng)用水為曝氣24 h以上的去氯自來水，溫度為（25±1）℃，pH為6.7～8.5。

1.1.3 供試藥品

螺蟲乙酯（含量98.12%，南京禾源化學(xué)有限公司）；吉姆薩（Giemsa）（北京索萊寶科技有限公司）、Tris飽和酚（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶K（北京全式金生物技術(shù)有限公司，20 mg/mL）、DNA Loading Buffer（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；丙酮（西隴化工有限公司）、吐溫80（西隴化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)

斑馬魚急性實(shí)驗(yàn)參照《OECD， Guidelines for the testing of chemicals，F(xiàn)ish acute toxicity test》[10]進(jìn)行。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，正式實(shí)驗(yàn)設(shè)置螺蟲乙酯的濃度梯度設(shè)置為2.5、2.97、3.54、4.20、5.00 mg/L（設(shè)置濃度方法如下：r=，r-相鄰兩組劑量的比值；b-最高致死量；a-最低致死量；n-設(shè)計(jì)的組數(shù)），并設(shè)曝氣水作為空白對照和溶劑對照。每個(gè)容器中放入10尾斑馬魚。分別在24、48、72、96 h時(shí)檢查受試斑馬魚的存活狀況及行為。并記錄斑馬魚的異常行為（如魚體側(cè)翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力減弱等），而且試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)測定所用水的pH和溫度，pH為6.7～8.5，溫度為（26±1）℃。同時(shí)選取重鉻酸鉀（GR） 作為參比物，重鉻酸鉀濃度分別為100、150、225、338、506 mg/L，測定斑馬魚的敏感性24 h的LC50。

根據(jù)GB/T21281-2007 《危險(xiǎn)化學(xué)品魚類急性毒性分級試驗(yàn)方法》中魚類96 h急性毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)[14]，進(jìn)行毒性分級。

1.2.2 斑馬魚DNA提取

酚-氯仿法參照PaaboS[8]等方法。改進(jìn)的酚-氯仿法：取平均體長（2±1）cm，平均體重（0.4±0.1）g的斑馬魚。試驗(yàn)前，斑馬魚樣本在-80 ℃的超低溫冷凍（1 h）。將斑馬魚分別放入300 μL組織提取液（Tris-C1 10 mmol/L，EDTA 0.1 mol/L，SDS 0.5%，pH=8.0）的1.5 mL離心管中，充分剪碎至勻漿狀態(tài)，加入300 μL組織提取液、加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL）和 5 μL RNA酶（20 mg/mL），充分混勻，于55 ℃水浴鍋消化至澄清。加入300 μL Tris飽和酚和300 μL氯仿抽提，充分混合10 min，13 000 r/min離心10 min，吸取上清加600 μL氯仿抽提，充分混合10 min，13 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，加1 000 μL無水乙醇沉淀DNA，5 000 r/min離心3 min，棄上清液，用70%乙醇洗2次，室溫下干燥，最后加40 μL 無菌水溶解DNA，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

吸取所提取的斑馬魚的基因組DNA 1 μL，以滅菌的去離子水為對照，在NanoDrop 2000蛋白核酸儀（上海創(chuàng)萌生物科技有限公司）上檢測其濃度以及A260/A280的比值。

用0.8%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測各濃度魚的基因組DNA，電壓130 V，室溫下電泳30 min左右，用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，并對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3 微核實(shí)驗(yàn)

于染毒后96 h，隨機(jī)選取各濃度及對照組的斑馬魚3條，濾紙拭去斑馬魚表面的水，用眼科剪刀剪尾，經(jīng)過肝素鈉濕潤過10 μL移液槍槍頭吸取外周血液，滴至潔凈的載玻片上，推玻片以30°勻速推動血滴，形成均勻的血膜。每尾魚制取2張片，晾干后用甲醇固定10 min左右。

將血涂片放置于染色架上，再用10%吉姆薩（Giemsa）溶液染色覆蓋全部血膜，室溫染色20 min。用蒸餾水從玻片的一頭沖洗，晾干。

以30 μg/mL環(huán)磷酰胺溶液作陽性對照。使用顯微鏡OLYMPUS BX51 圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0觀察并拍照。每張玻片統(tǒng)計(jì)3 000個(gè)細(xì)胞，并按下列公式計(jì)算微核細(xì)胞的千分率[13]。

微核率=觀察到的微核細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)×1 000‰

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS Statics17.0和Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，求得螺蟲乙酯對斑馬魚的細(xì)胞微核率及單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

重鉻酸鉀對斑馬魚24 h的LC50值為241 mg/L，滿足參比物重鉻酸鉀24 h的LC50值在200～400 mg/L，滿足OECD試驗(yàn)有效性要求。

螺蟲乙酯對斑馬魚的毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1。測得螺蟲乙酯96 h的LC50值為3.642 mg/L，為中毒。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測

2.2.1 分光光度法檢測

DNA質(zhì)量的分光光度法檢測純凈的DNA樣品A260/A280的比值應(yīng)為1.80，處于1.65～1.87，屬于正常，若高于1.80，表明樣品中可能含有RNA；若低于1.80，表明樣品中可能含有蛋白質(zhì)或苯酚。經(jīng)試驗(yàn)檢測，本試驗(yàn)A260/A280的比值在正常范疇內(nèi)（表2）。

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡

如若細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，則會在瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)180～200 bp整數(shù)倍的DNA梯形帶。由圖1可見，螺蟲乙酯處理組在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)180～200 bp整數(shù)倍的DNA梯形條帶，空白對照和溶劑對照沒有斷代現(xiàn)象，隨著螺蟲乙酯濃度的提高，電泳圖像尾部的梯形帶現(xiàn)象逐漸明顯。表明在較高濃度螺蟲乙酯溶液中的斑馬魚出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

2.3 微核試驗(yàn)

陽性對照環(huán)磷酰胺的微核率為16.2‰，與空白對照相比差異較顯著。螺蟲乙酯處理組微核試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度由低到高（2.50、2.97、3.54、4.20 mg/L）微核率依次升高。在p≤0.01水平各組之間均無顯著差異，在p≤0.05各處理與對照（溶劑對照）差異達(dá)顯著水平，其中2.50、2.97 mg/L兩個(gè)濃度差異不顯著，3.54、4.20 mg/L兩個(gè)濃度差異較顯著。見表3。

3 討論

本試驗(yàn)測得的螺蟲乙酯對斑馬魚幼魚96 h的LC50值為3.642 mg/L，該結(jié)果與毛晨蕾等的螺蟲乙酯對雌性斑魚的毒性和應(yīng)激反應(yīng)中所得到的7.21 mg/L（96 h）[7]有所不同，但同屬中毒范圍，作者認(rèn)為主要原因是本試驗(yàn)采用的是幼魚，而毛晨蕾等的試驗(yàn)采用的是成魚，幼魚較成魚對藥劑更為敏感；可能還與本試驗(yàn)用魚為AB型野生品系，遺傳背景比較清楚，毛晨蕾等試驗(yàn)采用的是從浙江省杭州市花鳥市場上購買的雌性斑馬魚有關(guān)。

根據(jù)目前的研究，提取動物基因組DNA 的方法較多，但總的來說，最為關(guān)鍵的有3點(diǎn)：（1）破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使DNA和蛋白質(zhì)釋放到提取液中；（2）消除蛋白質(zhì)，RNA 等雜質(zhì)的污染；（3）防止DNA的消解，利用常溫方法提取基因組DNA 的步驟較為繁瑣復(fù)雜，使用的試劑較多，且提取的DNA 質(zhì)量不高，含蛋白，RNA 等雜質(zhì)[14]，本試驗(yàn)在傳統(tǒng)的酚-氯仿提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，直接將試樣組織放入-80℃中冷凍1 h，使組織在低溫下能充分破碎，加適量的提取液，保證提取液最大程度地破壞細(xì)胞壁，使白酶K和RNA酶達(dá)到最大的消化效率。采用55℃的恒溫水浴鍋溫浴，直至離心管中澄清透明，在此期間，經(jīng)常對離心管進(jìn)行倒轉(zhuǎn)混勻，以防止出現(xiàn)沉淀影響消化效率[15]且整個(gè)提取過程不需要低溫離心，操作簡單，提取的DNA質(zhì)量明顯高于傳統(tǒng)常溫的酚-氯仿法。

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，它是細(xì)胞接收死亡信號產(chǎn)生的一種受其自身基因調(diào)控的主動自殺的生物學(xué)過程。DNA ladder方法觀察，其特征表現(xiàn)為凝膠電泳呈現(xiàn)DNA梯狀帶。在Caspase家族半胱氨酸蛋白酶在凋亡中的關(guān)鍵作用發(fā)現(xiàn)以前，人們所認(rèn)識到的細(xì)胞凋亡的最主要特征是DNA發(fā)生核小體間的斷裂，結(jié)果產(chǎn)生含有不同數(shù)量核小體單位的片段，在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，形成了特征性的梯狀條帶（DNA ladders）[15]其大小為180～200 bp的整數(shù)倍。目前，梯狀條帶仍然是鑒定細(xì)胞凋亡較可靠的方法[16]。使用改進(jìn)后的酚-氯仿法，提取出斑馬魚基因組DNA純度較高，方法簡便易于操作，并且保證了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。瓊脂糖凝膠電泳成像中DNA條帶清晰，完整，拖帶不明顯，且隨著染毒螺蟲乙酯濃度的逐漸增加，電泳圖片逐漸出現(xiàn)梯狀條帶，分析是細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

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