袁霜雪，王東旭，伍秋香，陳前昭，李 洋，曾于樺，邵 英，黃 軍，劉映孜，何百成

(1.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

白藜蘆醇抑制HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與Wnt/β-catenin的關(guān)系研究

袁霜雪1，2，王東旭1，2，伍秋香1，2，陳前昭1，2，李 洋1，2，曾于樺1，2，邵 英1，2，黃 軍1，2，劉映孜1，2，何百成1，2

(1.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016)

目的 研究白藜蘆醇(resveratrol, Res)對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用及可能的分子機(jī)制。方法 采用結(jié)晶紫染色和Western blot分析Res對HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分析Res對HCT116細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用；利用TCF4/LEF螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測Res對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。采用Western blot 和PCR分析Res對HCT116細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)水平的影響。 結(jié)果 與對照組相比，Res能抑制HCT116細(xì)胞增殖，下調(diào)PCNA蛋白水平; 流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測結(jié)果均顯示，Res 能明顯促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡; 報(bào)告質(zhì)粒分析結(jié)果顯示，Res呈濃度依賴性降低TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒螢光素酶活性(Res為20 μmol·L-1時(shí)，P<0.05; Res為40或80μmol·L-1時(shí)，P<0.01)；Western blot和PCR分析結(jié)果顯示，Res不僅明顯降低HCT116細(xì)胞中β-catenin的蛋白水平，同時(shí)也下調(diào)β-catenin mRNA的表達(dá)水平。結(jié)論 Res能抑制HCT116細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能至少與Res下調(diào)β-catenin mRNA表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

白藜蘆醇；結(jié)腸癌；增殖抑制；凋亡；TCF4/LEF；Wnt/β-catenin

白藜蘆醇(resveratrol, Res)又名芪三酚，是一種天然多酚類物質(zhì)，主要來源于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物[1-2]。Res作為一種抗氧劑, 臨床可用于動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、缺血性心臟病和高血脂等疾病的防治[3-4]。近年研究表明，Res對多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用，如肺癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞。但具體機(jī)制目前仍不十分清楚。

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌和肝癌，嚴(yán)重危害人類的健康[5]。雖然結(jié)腸癌的診斷和治療方法已有較大的發(fā)展，但目前結(jié)腸癌的治療效果仍不理想，面臨的挑戰(zhàn)主要包括傳統(tǒng)化療藥物的細(xì)胞毒性及結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[6]。Wnt/β-catenin信號異?；罨墙Y(jié)腸癌發(fā)生的重要原因之一[7]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，由于β-catenin或APC突變，導(dǎo)致β-catenin不能被降解。結(jié)果引起β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)大量聚積并轉(zhuǎn)位入核，與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(如TCF4/LEF)結(jié)合促進(jìn)下游某些原癌基因表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，Res能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，這種作用可能與Res調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[8]，但Res對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。

本研究通過檢測Res對HCT116細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并分析Res的這種作用是否與其抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)；最后分析Res調(diào)控Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能機(jī)制。本研究為將Res作為抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物治療結(jié)腸癌提供新的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 試劑及細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。白藜蘆醇購自西安昊軒生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司。 Lipofectamine 購自Invitrogen公司。HCT116細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(高糖)培養(yǎng)細(xì)胞(含10%胎牛血清、105U·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素)，培養(yǎng)條件為5%的CO2及37 ℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組將HCT116細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。用DMSO溶解Res，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的Res處理(20、40、60、80及100 μmol·L-1)，對照組用相同體積DMSO處理。

1.3 結(jié)晶紫染檢測細(xì)胞增殖將細(xì)胞鋪于24孔板，用不同濃度Res(20、40、60、80、100 μmol·L-1)處理。分別在處理后24、48和72 h進(jìn)行結(jié)晶紫染色[9]，檢測細(xì)胞增殖情況。方法如下：棄培養(yǎng)基，用PBS小心清洗孔板一次。每孔加500 μL結(jié)晶紫飽和溶液，在室溫下孵育20 min。移去結(jié)晶紫染液，用PBS小心清洗3次。室溫下將孔板晾干后掃描。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式分析檢測細(xì)胞凋亡將處于指數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于6孔板中，待其貼壁后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度Res(20、40、80 μmol·L-1)。24 h后收集細(xì)胞，先用PBS (4 ℃) 清洗，然后分別用Annexin-V EGFP和PI處理細(xì)胞(按試劑盒操作說明進(jìn)行)；最后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性將處于指數(shù)生長狀態(tài)的細(xì)胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁后，用lipofectamine轉(zhuǎn)染TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒 (pTOP-Luc) 3 μg, 4 h后換液。12 h后將細(xì)胞消化并重新種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度Res(20、40、80 μmol·L-1)進(jìn)行處理。24 h后，裂解細(xì)胞，收集裂解液，并按照試劑盒操作說明進(jìn)行螢光素酶活性測定。用BCA法測定裂解液總蛋白濃度(用以校正螢光素酶活性)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)將處于指數(shù)生長期的細(xì)胞種于6孔板中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度的Res(20、40、80 μmol·L-1)，并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)提取各組總蛋白。 采用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，按常規(guī)操作方法進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。最后采用ECL試劑盒顯影并成像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 RNA提取及RT-PCR實(shí)驗(yàn)RT-PCR實(shí)驗(yàn)按如下步驟進(jìn)行：將細(xì)胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度的Res(20、40、80 μmol·L-1)，并用含1%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。 TRIzol法提取總RNA， 通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，然后進(jìn)行PCR檢測目的基因mRNA表達(dá)水平。所用引物如下：GAPDH上游引物 5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′，下游引物 5′-AGGGGAGATTCAGTGTG GTG-3′ ；β-catenin上游引物 5′-CTGC AGGGGTCCTCTGTG-3′，下游引物 5′-TGCATATGTCGCCACACC-3 ′。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Res對HCT116細(xì)胞增殖的影響本研究首先分析Res對HCT116細(xì)胞的增殖影響。結(jié)晶紫染色分析結(jié)果顯示(Fig 1A)，與對照組相比，Res處理組HCT116細(xì)胞的增殖明顯呈濃度依賴性抑制，并且這種作用隨著藥物作用時(shí)間延長而增強(qiáng)；Res在40 μmol·L-1時(shí)已能明顯抑制HCT116細(xì)胞生長。 Western blot分析結(jié)果顯示，Res對增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)也具有明顯抑制作用(Fig 1B)。以上結(jié)果提示，Res能抑制HCT116增殖。

2.2 Res對HCT116細(xì)胞凋亡的影響誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物的重要特點(diǎn)之一。Western blot分析結(jié)果顯示(Fig 2A)，Res不同濃度處理組Caspase-3蛋白水平明顯高于對照組，并呈濃度依賴性增加，Caspase-3蛋白水平在48 h升高更明顯。

Fig 1 Effect of Res on proliferation in HCT116 cells

A: Crystal violet staining results showed the anti-proliferation effect of Res in HCT116 cells; B: Western blot results showed the effect of Res on the protein level of PCNA in HCT116 cells.

Annexin-V EGFP/PI雙染流式分析結(jié)果顯示(Fig 2B)，與對照組相比，Res處理組凋亡細(xì)胞比例明顯隨藥物濃度增加而升高。結(jié)果提示, Res 對HCT116細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。

Fig 2 Effect of Res on apoptosis in HCT116 cells

A: Western blot results showed the effect of Res on Caspase-3 in HCT116 cells; B: Flow cytometry analysis results showed the effect of Res on apoptosis in HCT116 cells.

2.3 Res對HCT116細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Wnt/β-catenin信號異常激活是結(jié)腸癌的重要發(fā)病原因之一。因此，抑制Wnt/β-catenin信號是抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的重要靶點(diǎn)之一。 螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒分析結(jié)果顯示，與對照組相比，Res對TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性具有明顯抑制作用(Fig 3)，并且這種抑制作用呈濃度依賴性增加。結(jié)果提示，Res對HCT116細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制作用。

Fig 3 Effect of Res on Wnt/β-catenin signal transduction in HCT116 cells

Luciferase reporter assay results showed the effect of Res on Wnt/β-catenin signal transduction in HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4 Res對HCT116細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的影響β-catenin在Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要作用。Western blot分析結(jié)果顯示，與對照組相比，Res處理組β-catenin蛋白水平明顯呈濃度依賴性下降(Fig 4A)。由于HCT116細(xì)胞中存在β-catenin突變而無法被降解復(fù)合物降解，所以Res對β-catenin蛋白水平的降低可能與β-catenin mRNA表達(dá)降低有關(guān)。進(jìn)一步PCR分析結(jié)果顯示，與對照組相比，Res處理HCT116細(xì)胞后能明顯降低β-catenin 的mRNA表達(dá)水平(Fig 4B)。結(jié)果提示，Res對HCT116細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用很可能與其下調(diào)β-catenin的mRNA表達(dá)有關(guān)。

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率均較高,僅次于肝癌、肺癌及胃癌, 對人類健康的危害很大, 每年全球約有50萬患者死于結(jié)腸癌[6]。目前雖然對結(jié)腸癌的診斷和治療水平都有了較大提高，但結(jié)腸癌的預(yù)后仍不樂觀。植物藥來源的有效單體成份在各種腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用[10-11]。本研究表明，Res對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，并能促進(jìn)凋亡；這種作用可能與Res通過下調(diào)β-catenin mRNA表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

Fig 4 Effect of Res on β-catenin in HCT116 cells

A：Western blot results showed the effect of Res on the level of β-catenin in HCT116 cells；B：PCR results showed the effect of Res on the expression of β-catenin in HCT116 cells.

研究表明, 大部分結(jié)腸癌發(fā)病與遺傳因素?zé)o關(guān)[12]，Wnt信號的異常激活是結(jié)腸癌發(fā)生的重要原因之一[7]。該信號參與個(gè)體胚胎發(fā)育及正常生理功能調(diào)節(jié)，分為經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路。 在經(jīng)典Wnt信號通路中，β-catenin對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著中樞作用；非經(jīng)典Wnt信號通路包括細(xì)胞極性及鈣依賴性信號，和經(jīng)典Wnt信號一樣與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[7,13-14]。在經(jīng)典Wnt信號通路中，Wnt配體與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled/FZD, Wnt的受體)結(jié)合，使β-catenin降解復(fù)合物Axin-APC-GSK3β無法形成，從而使β-catenin降解受到抑制而在胞內(nèi)聚集，最后轉(zhuǎn)位入核，與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(如T-cell factor 4/lymphoid enhancer factor, TCF4/LEF)結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)。反之，當(dāng)Wnt 受體未與Wnt配體結(jié)合時(shí)，胞內(nèi)β-catenin降解復(fù)合物形成，促進(jìn)β-catenin降解，抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號異?；罨赡芘c調(diào)節(jié)β-catenin蛋白水平的重要因子發(fā)生突變有關(guān)，如APC突變[7，14]。因此，β-catenin成為治療結(jié)腸癌藥物的重要靶點(diǎn)之一。

白藜蘆醇(Res)是一種天然多酚類物質(zhì)，主要來源于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物。近年研究表明，Res能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，如肺癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等。這種作用可能與Res抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，但具體機(jī)制仍不十分清楚[8]。本研究通過結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)，Res能夠明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖(Fig 1A)。PCNA是細(xì)胞增殖啟動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子，其蛋白水平可以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。本研究分析表明，Res也能明顯降低HCT116細(xì)胞中的PCNA蛋白水平(Fig 1B)，進(jìn)一步證實(shí)Res能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-aspartic proteases,Caspase)屬于半胱氨酸蛋白水解酶類，在細(xì)胞的凋亡、壞死及炎癥反應(yīng)中具有重要作用。其中，Caspase-8和Caspase-9被認(rèn)為是凋亡的啟動(dòng)者，而caspase-3是凋亡的執(zhí)行者。另外，在凋亡的早期，處于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸翻向外側(cè)。 Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可與細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，是檢測細(xì)胞早期凋亡的特異性指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，Res能明顯增強(qiáng)Caspase-3蛋白水平(Fig 2A)，流式分析結(jié)果也顯示Res處理后Annexin V陽性細(xì)胞比例明顯增加(Fig 2B)。以上結(jié)果表明，Res不僅能抑制HCT116細(xì)胞增殖，也能促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡。

由于經(jīng)典Wnt/β-catenin信號異常活化是結(jié)腸癌的重要發(fā)病原因之一[7]，所以本研究利用TCF4/LEF螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pTOP-Luc)分析Res對Wnt/β-catenin信號的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Res能明顯抑制TCF4/LEF報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性(Fig 3)。這一結(jié)果提示Res對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Res能明顯降低HCT116細(xì)胞內(nèi)的β-catenin蛋白水平(Fig 4A)。由于HCT116細(xì)胞中β-catenin本身存在突變，已形成的降解復(fù)合物無法加速β-catenin降解。因此，在這些腫瘤細(xì)胞中，β-catenin能在胞質(zhì)內(nèi)聚積并轉(zhuǎn)位入核，持續(xù)激活Wnt/β-catenin信號[15]。由此，我們推測，Res降低β-catenin的蛋白水平可能與抑制β-catenin mRNA表達(dá)有關(guān)。 PCR分析結(jié)果顯示，Res對β-catenin mRNA表達(dá)具有明顯抑制作用(Fig 4B)。以上結(jié)果表明，Res能通過下調(diào)β-catenin mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，但Res對β-catenin mRNA表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制仍不清楚。

本研究結(jié)果表明，Res能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，這種作用與抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)；Res在結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能通過下調(diào)β-catenin mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)。但是，Res對β-catenin mRNA表達(dá)調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。課題組將利用其他結(jié)腸癌細(xì)胞株，進(jìn)一步確認(rèn)Res抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長與Wnt/β-catenin的關(guān)系；深入分析Res對β-catenin表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)制，為將Res用于對結(jié)腸癌的臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Study on the relationship between anti-proliferation effect of resveratrol on HCT116 colon cancer cells and Wnt/β-catenin

YUAN Shuang-xue1,2, WANG Dong-xu1,2, WU Qiu-xiang1,2, CHEN Qian-zhao1,2, LI Yang1,2,ZENG Yu-hua1,2,SHAO Ying1,2, HUANG Jun1,2, LIU Ying-zi1,2, HE Bai-cheng1,2

(1.ChongqingKeyLabrotoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,2.Deptofpharmacology,PharmacySchoolofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To investigate the anti-proliferation effect of resveratrol (Res) on human colon cancer cells and dissect the possible mechanism underlaying this effect. Methods We introduced crystal violet staining and Western blot to analyse the anti-proliferation effect of Res on HCT116 cells. Then, we used flow cytometry and Western blot assay to detect the Res induced apoptosis in HCT116 cells. Next, we employed the well established TCF4/LEF luciferase reporter to measure the effect of Res on Wnt/β-catenin signaling transduction. Finally, we took Western blot and PCR assay to analyse the effect of Res on the expression of β-catenin in HCT116 cells. Results Crystal violet staining and Western blot analysis showed that Res could inhibit the proliferation of HCT116 cells in a concentration-and time dependent fashion. What’s more, Res could promote apoptosis in HCT116 cells. The transcriptional activities of TCF4/LEF reporter were reduced by Res in a concentration-dependent fashion (P<0.05 when the concentration of Res was 20 μmol·L-1, andP<0.01 when the concentration of Res was 40 μmol·L-1or 80 μmol·L-1). Res could decrease not only the protein level of β-catenin in HCT116 cells, but also the mRNA expression of β-catenin. Conclusion Res can inhibit the proliferation of HCT116 cells, which may be mediated at least by down-regulating the expression of β-catenin to inhibit the Wnt/β-catenin signaling transduction.

resveratrol; colon cancer; anti-proliferation; apoptosis; TCF4/LEF; Wnt/β-catenin

時(shí)間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.001.html

2014-11-20,

2015-01-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81372120)

袁霜雪(1987-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail:354694274@qq.com； 何百成(1972-)，男，博士，教授，研究方向：分子藥理學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)，通訊作者，E-mail: hebaicheng99@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.020

A

1001-1978(2015)04-0537-05

R-332；R329.24;R329.25;R735.350.22;R977.6