汪麗佳，邱紅梅，蔣心惠，劉 丹，費慧芝，胡小婭，周岐新

(1.重慶市生物化學(xué)和分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶 400016；2.重慶市中山醫(yī)院，重慶 400015；3.重慶市三峽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，重慶 404100)

CUS致大鼠抑郁行為涉及單胺遞質(zhì)合成酶表達下調(diào)

汪麗佳1，邱紅梅1，蔣心惠1，劉 丹2，費慧芝3，胡小婭1，周岐新1

(1.重慶市生物化學(xué)和分子藥理學(xué)重點實驗室，重慶 400016；2.重慶市中山醫(yī)院，重慶 400015；3.重慶市三峽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，重慶 404100)

目的 探討慢性不可預(yù)知性刺激(chronically unpredicted stress，CUS)致大鼠抑郁行為與單胺遞質(zhì)合成限速酶色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)表達的關(guān)系。方法 ♂SD大鼠30只，隨機分為對照組(control group，CG)和模型組(model group，MG)，每組15只。采用連續(xù)給予CUS結(jié)合孤養(yǎng)28 d建立抑郁模型；對照組每籠5只，正常飼養(yǎng)；以開場試驗和糖水消耗實驗進行行為學(xué)評價；以熒光定量PCR測定海馬、前腦皮層TPH 及TH mRNA表達，以Western blot法測定海馬、前腦皮層TPH 及TH蛋白表達。結(jié)果 與CG相比，MG大鼠開場實驗水平和垂直活動得分均明顯降低，糖水消耗量也顯著減少，海馬、前腦皮層TPH及TH mRNA和蛋白表達均明顯下降。結(jié)論 CUS誘導(dǎo)♂大鼠產(chǎn)生抑郁癥樣行為，其發(fā)生機制可能與單胺遞質(zhì)合成限速酶TPH、TH表達下調(diào)相關(guān)。

抑郁癥；慢性不可預(yù)見性刺激；色氨酸羥化酶；酪氨酸羥化酶；5-羥色胺；去甲腎上腺素

抑郁癥的發(fā)病機制存在眾多假說。早期研究認為，抑郁癥的發(fā)生與神經(jīng)單胺遞質(zhì)缺乏相關(guān)。隨著研究的深入，進一步發(fā)現(xiàn)氧化/抗氧化應(yīng)激損傷、下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic- pituitary-adrenal axis，HPA)功能失調(diào)、神經(jīng)營養(yǎng)因子減少及炎癥反應(yīng)等都參與了抑郁癥的發(fā)生[1-3]。其中，“單胺學(xué)說”是目前抑郁癥發(fā)病機制最重要的假說之一。該學(xué)說認為突觸間隙的5-羥色胺(serotonin，5-HT)及去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)水平低下是導(dǎo)致抑郁癥的重要原因[1]。單胺神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用需經(jīng)歷遞質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運、代謝過程。通過阻止神經(jīng)末梢對遞質(zhì)再攝取或抑制遞質(zhì)降解而研發(fā)出一系列臨床行之有效的經(jīng)典抗抑郁藥物，如選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)和單胺氧化酶抑制劑等。但即便如此，作為臨床廣泛使用的SSRI等治療抑郁癥通常需要幾周才能完全發(fā)揮作用，并且約有60%～70%的病人治療無效[4]，其原因尚不明確。有報道認為，大腦單胺遞質(zhì)缺乏的小鼠對SSRI治療無應(yīng)答[5]。因此，增加突觸間隙單胺遞質(zhì)濃度是否可以通過增加遞質(zhì)合成達到抗抑郁治療值得考慮。TPH和TH分別是合成5-HT以及兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)(去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺)的限速酶。有研究發(fā)現(xiàn)，TPH基因多態(tài)性與抑郁癥關(guān)系密切，并提出將TPH作為抗抑郁治療的新靶點[6]。抑制TH活性可產(chǎn)生抑郁樣行為，增加大腦TH水平可用于治療抑郁癥[7]。因此，本文從單胺遞質(zhì)的合成出發(fā)，采用CUS誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抑郁行為，觀察5-HT和NE的合成限速酶表達是否參與了抑郁癥的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 動物清潔級♂Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，180～220 g，重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，醫(yī)學(xué)動物許可證號：SCXK(渝)2007-0001。

1.2 主要試劑與儀器PCR引物(上海鼎安生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑盒Total RNA Kit I(OMEGA公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa公司，大連寶生物)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司,大連寶生物)；anti-TH、anti-TPH(美國Millipore公司)；WB山羊抗兔IgG二抗(北京中杉)；ECL發(fā)光液：Super Signal Western Blotting Kits(Pierce公司)；實時定量PCR儀：美國Bio-rad公司(型號：MJ7500)；凝膠成像系統(tǒng)：Bio-rad公司(型號：170-1870)；WB垂直電泳儀：美國Bio-rad公司；低溫離心機(Eppendoff)。

1.3 分組及飼養(yǎng)大鼠自由攝食飲水，正常光照節(jié)律。在室溫(20±3)℃實驗環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用open field法篩選大鼠，選取水平活動得分30～120之間的大鼠隨機分為2組，即對照組(CG)和模型組(MG)，每組15只；CG組5只/籠， MG組每只大鼠單籠喂養(yǎng)。

1.4 孤養(yǎng)結(jié)合CUS方法建立大鼠抑郁模型參照Willner等[8]方法并加以改進，建立實驗性大鼠抑郁模型。刺激方式包括禁食禁水24 h, 夾尾1 min, 間歇照明(光/暗周期為2 h/2 h，時間19 ∶00 ～次日7 ∶00)，通宵(12 h)照明，傾斜鼠籠45°結(jié)合禁水24 h, 45 ℃熱環(huán)境5 min, 4 ℃冰水游泳5 min，電刺激(36 V，4 Hz)5 min, 噪音1 h, 空盒無墊料結(jié)合禁食24 h，潮濕墊料24 h，共11種刺激，大鼠每天接受一種刺激，每種刺激累計出現(xiàn)2 ～3次，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使動物不能預(yù)料何種刺激會發(fā)生，實驗周期為28 d。

1.5 開場實驗?zāi)Ｐ徒⒑螅赿 2早上7 ∶30進行開場實驗。參考文獻[9]，使用自制100 cm×100 cm×40 cm木箱，底部平均分為5×5個方格，木箱內(nèi)全部漆成黑色。保持環(huán)境安靜，將大鼠置于木箱中央，觀察大鼠5 min內(nèi)活動情況，記錄大鼠的水平得分(四爪均進入方格的穿越格數(shù))、垂直得分(后肢直立次數(shù))。觀察完畢后，酒精清潔敞箱后再進行下一次觀察,以免受上次大鼠遺留氣味的影響。

1.6 糖水消耗實驗參照文獻，在模型建立d 26，先訓(xùn)練大鼠試飲10 g·L-1蔗糖水24 h，d 27飲純水24 h，訓(xùn)練期間正常進食。訓(xùn)練結(jié)束后開始正式實驗：禁食禁水24 h后，所有大鼠單籠放置，同時給予10 g·L-1蔗糖水和純水各1瓶,實驗前稱取帶水瓶重。2 h后，再次稱量帶水瓶重并記算蔗糖水和純水消耗量，最終計算糖水偏好率(糖水偏好率/%=糖水消耗/總液體消耗×100 %)。

1.7 TPH、TH mRNA表達測定造模結(jié)束，每組取5只大鼠，經(jīng)40 g·L-1水合氯醛(400 mg·kg-1, ip)麻醉后斷頭取腦組織，冰上分離前腦皮層和海馬，置于裝有RNAstore組織保存液(每100 mg組織加入1 mlRNAstore)EP管。4℃過夜，移出液體，組織于-80℃保存。TH引物：上游5′-AGAGGACAGCATCCCACAGC-3′，下游5′-ATCACGGGCGGACAGTAGA-3′；TPH引物：上游5′-TTTGTAGCCAACATTCCTCA-3′，下游5′-ACTATTGAAAGTAGAAACCACCTC-3′；β-actin作內(nèi)參。擴增產(chǎn)物大小分別為100 bp, 132 bp和100 bp。以TRIzol法按試劑盒說明書提取樣本總RNA, 用TIANGEN試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)參見試劑盒說明書：1 μL DNA樣本作為 PCR 擴增模板，陰性對照擴增模板為去離子水；擴增條件為95 ℃預(yù)變性2 min； 隨后95 ℃ 10 s，退火15 s，72 ℃ 延伸45s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。本試驗采用⊿⊿CT法進行實時定量PCR相對定量反應(yīng)，樣本均采用的三復(fù)管。取平均值作為最終試驗結(jié)果，然后與內(nèi)參進行比較，計算相對含量。

1.8 TPH、TH蛋白表達測定按“1.7”方法處理大鼠，冰上分離出前腦皮層和海馬，剪碎組織，加裂解液處理，提取蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度。采用Western blot 方法檢測兩腦區(qū)TH和TPH蛋白表達。每孔上樣量為50 μg, 進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜、洗膜，加入二抗，室溫封閉30 min后洗膜，凝膠成像系統(tǒng)取像，以β-actin蛋白做為內(nèi)參校正蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為變化開場實驗結(jié)果顯示，與CG組相比，CUS致大鼠(MG組)水平得分和垂直得分均明顯降低(P<0.01,P<0.05),見Fig 1。糖水實驗結(jié)果顯示，MG組大鼠糖水消耗量明顯低于CG組(P<0.05),見Tab 1，提示CUS成功誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮、興趣缺失等抑郁樣行為。

Tab 1 Effect of CUS on the sucrose preference of ±s，n=15)

*P< 0.05vsCG

*P<0.05,**P<0.01vsCG

2.2 大鼠腦內(nèi)TPH mRNA及蛋白表達與CG組比，MG組大鼠海馬和前腦皮層TPH mRNA表達量明顯降低(海馬P<0.01，皮層P<0.05)，見Tab 2，同時MG組海馬和前腦皮層TPH蛋白表達也明顯下降(P<0.05),見Fig 2。提示CUS誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抑郁行為時，使海馬和前腦皮層5-HT合成限速酶表達量明顯降低。

2.3 大鼠腦內(nèi)TH mRNA及蛋白表達與CG組相比，MG組大鼠海馬和前腦皮層TH mRNA表達量明顯降低(海馬P<0.01，皮層P<0.05)，見Tab 2。，同時MG組海馬和前腦皮層TH蛋白表達也明顯下降(海馬P<0.05，皮層P<0.01)，見Fig 3，結(jié)合TPH表達結(jié)果，顯示CUS能明顯抑制大鼠單胺合成限速酶TPH和TH的表達。

GroupTPHmRNAexpressionHippocampusCortexTHmRNAexpressionHippocampusCortexCG0.935±0.3930.961±0.4000.887±0.2660.915±0.395MG0.217±0.089**0.322±0.193*0.265±0.104**0.272±0.153*

*P<0.05,**P<0.01vsCG

Fig 2 Effect of CUS on TPH protein

*P<0.05vsCG

3 討論

CUS是目前經(jīng)典、常用的實驗鼠抑郁模型建立方法。其主要原理是模擬人類抑郁癥形成中受到的不同慢性低水平的應(yīng)激源刺激。開場實驗和糖水消耗實驗可分別測定實驗動物焦慮抑郁行為和是否存在快感缺失。為此本課題組以CUS誘導(dǎo)建立大鼠抑郁模型，對腦內(nèi)單胺遞質(zhì)合成、再攝取和代謝進行了系列研究。前期工作發(fā)現(xiàn)，CUS誘導(dǎo)的抑郁模型鼠存在轉(zhuǎn)運體表達異常，文拉法辛和瑞波西汀能逆轉(zhuǎn)這種表達異常而改善大鼠抑郁癥狀[9-10]。然而，針對臨床使用SSRI等抗抑郁藥物的低治愈率使得人們有理由考慮，抑郁癥發(fā)生機制是否也與單胺遞質(zhì)合成酶表達異常有關(guān)。為此，采用經(jīng)典的CUS結(jié)合孤養(yǎng)方法建立大鼠抑郁癥模型是探討抑郁行為與單胺遞質(zhì)合成酶表達關(guān)系的最簡潔明了的途徑。

Fig 3 Effect of CUS on TH protein

*P<0.05,**P<0.01vsCG

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CUS刺激的大鼠開場實驗水平得分和垂直得分均明顯低于對照組；糖水消耗實驗也顯示CUS大鼠糖水?dāng)z取量明顯低于對照組，提示CUS誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)焦慮、快感缺失等抑郁行為。本研究還發(fā)現(xiàn)， 模型組大鼠海馬和前腦皮層TPH以及TH mRNA和蛋白表達均明顯低于對照組。已知大鼠海馬和前腦皮層與認知功能、學(xué)習(xí)記憶和情感等密切相關(guān)，提示CUS致大鼠焦慮抑郁可能涉及該腦區(qū)的TPH和TH表達下調(diào)。

TPH和TH分別是5-HT和NE合成的限速酶。5-HT作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)作用于HPA軸、參與涉及交感神經(jīng)系統(tǒng)的壓力應(yīng)答，其功能失調(diào)會引起精神障礙。TPH作為5-HT的合成限速酶，有報道認為，5-HT前體物質(zhì)色氨酸不足或限速酶TPH活性降低可誘發(fā)抑郁癥狀[11]。采用母嬰分離方法建立幼鼠抑郁模型，發(fā)現(xiàn)其成年后中縫核TPH表達降低。此外，也有多篇TPH基因多態(tài)性涉及抑郁癥發(fā)生的報道，并認為可將TPH作為抗抑郁藥物研究的新靶點[6]。這些均支持TPH表達下調(diào)與抑郁癥發(fā)生的確有關(guān)。最近報道，傳統(tǒng)中藥制劑開心丸在升高海馬及前腦皮層5-HT水平的同時，明顯增加TPH的表達[12]。同樣，有報道提升TH表達可改善在強迫游泳和懸尾實驗中大鼠的絕望行為[13]，電休克抗抑郁治療與明顯提高TH基因表達有關(guān)[14]。結(jié)合TPH的報道，在本次研究中模型組大鼠海馬和前腦皮層TPH、TH mRNA及蛋白表達均降低，意味相關(guān)區(qū)域的腦神經(jīng)5-HT、NE遞質(zhì)合成減少，進而釋放到突觸間隙的5-HT和NE也減少；這可能與抑郁癥的“單胺學(xué)說”發(fā)生機制不謀而合。因此，單胺遞質(zhì)合成酶是否可以作為單胺遞質(zhì)再攝取抑制劑低療效的補充治療靶點值得進一步探討。

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Down-regulation of monoamine neurotransmitter synthetase expression involved in CUS-induced depression of rats

Wang Li-jia1, Qiu Hong-mei1, Jiang Xin-hui1, Liu Dan2, Fei Hui-zhi3, Hu Xiao-ya1, Zhou Qi-xin1

(1.DeptofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing400016，China；2.ChongqingZhongshanHospital，Chongqing400015,China；3.ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Chongqing404100,China)

Aim To investigate whether chronically unpredictable stress(CUS)-induced depression-like behaviors of rats is associated with the variant expression of tryptophan hydroxylase (TPH) and tyrosine hydroxylase (TH). Methods 30 male SD rats were randomly divided into depression model group(MG) and control group(CG)，the former was established using CUS plus solitary condition for 28 d, whereas the latter was fed normally as five rats per cage without CUS. The open field test(OFT)and the sucrose preference test were used to evaluate depressive behaviors. Both mRNA and protein expressions of TPH and TH in hippocampus and forebrain cortex were determined by real-time fluorescent quantitative PCR and western blot (WB), respectively. Results MG rats showed obvious depressive behaviors with much lower locomotive activity and sucrose preference than CG. Meanwhile, the mRNA and protein expressions of TPH and TH also significantly decreased in MG rats, compared with CG rats. Conclusion The depression behaviors of rats induced by CUS may be associated with down-regulation of TPH and TH expression.

depression；CUS；TPH；TH；5-HT；NE

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.026.html

2014-11-03,

2015-02-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31400881)；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(No KJ1400208)

汪麗佳(1987-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：492759231@qq.com； 周岐新(1947-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)精神藥理學(xué)，E-mail：cqzhouqx@cqmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.018

A

1001-1978(2015)04-0527-05

R-332；R322.81；R338.1；R345.47；R749.42；R977.3