黃小華， 孫 永，沈 能，唐華東，任 紅，彭明利

(1.重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400010；2.重慶市腫瘤醫(yī)院，重慶 400030；3.浙江工業(yè)大學，浙江 杭州 310014)

◇論 著◇

雙親姜黃素衍生物減輕大鼠肝纖維化與抗炎抗氧化作用的研究

黃小華1， 孫 永1，沈 能2，唐華東3，任 紅1，彭明利1

(1.重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400010；2.重慶市腫瘤醫(yī)院，重慶 400030；3.浙江工業(yè)大學，浙江 杭州 310014)

目的 探討新型雙親姜黃素衍生物(curc-OEG)對四氯化碳(CCl4)誘導大鼠肝纖維化的抗炎抗氧化作用。方法 大鼠分為正常組、模型組、姜黃素組和姜黃素衍生物組。除正常組外，其余各組給予CCl4混合液皮下注射，每周2次。造模4周后，正常組、模型組給與尾靜脈注射生理鹽水，姜黃素組給予姜黃素400 mg·kg-1·d-1灌胃治療，姜黃素衍生物組給予姜黃素衍生物100 mg·kg-1·d-1尾靜脈注射。治療4周后分別取血清及肝組織標本。血清檢測ALT、AST水平；肝組織做病理學檢查，Real-time PCR法檢測相關(guān)炎癥因子的mRNA表達水平,試劑盒檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平。結(jié)果 正常組、模型組、姜黃素組和姜黃素衍生物組ALT水平分別為：(31.7±8.7) U·L-1、(383.0±75.6) U·L-1、(406.3±204.7) U·L-1、(107.0±73.7) U·L-1；AST水平分別為：(137.7±32.7) U·L-1、(585.3±36.7) U·L-1、(485.0±246.5) U·L-1、(202.7±56.0) U·L-1，姜黃素衍生物較姜黃素顯示出更好的護肝降酶作用(P<0.05)。肝臟病理切片顯示姜黃素衍生物較姜黃素具有更明顯的延緩肝臟脂肪變性、減輕炎癥細胞浸潤及抗肝纖維化的作用。與姜黃素比較，姜黃素衍生物明顯下調(diào)炎癥相關(guān)因子NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2mRNA及蛋白表達水平(P<0.05)；明顯降低肝組織中MDA水平，提高GSH 、SOD表達水平，增強抗氧化能力。結(jié)論 姜黃素衍生物較傳統(tǒng)姜黃素具有更好的抗炎、抗氧化作用，能夠有效地延緩四氯化碳誘導的肝纖維化進程。

姜黃素；灌胃治療；衍生物；靜脈注射；纖維化；抗炎；抗氧化

肝纖維化是對慢性肝損傷(病毒性感染、酗酒、膽汁淤積等)的一種創(chuàng)傷修復反應(yīng)，是過多的細胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生和沉積的病理過程[1]。慢性肝損傷導致大量炎癥細胞的聚集，釋放炎癥因子和生長因子，如TNF-α、TGF-β1，從而激活肝星狀細胞(HSC)， 而活化的HSC是ECM(特別是膠原纖維)生成的主要來源[2]。姜黃素是一種天然的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化藥理作用，能夠抑制脂肪氧合酶和環(huán)氧化酶-2(COX-2)的活性，抑制脂質(zhì)過氧化，減少花生四烯酸的釋放，特別是通過抑制NF-kB信號通路減少炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成[3]。但姜黃素(curcumin)水溶性差，在酸性條件下幾乎不溶于水，在中性和堿性條件下迅速降解，故其難以直接制作成靜脈注射劑型[4]。圍繞姜黃素為先導化合物，進行結(jié)構(gòu)修飾和劑型改變，提高姜黃素生物利用度是突破姜黃素臨床應(yīng)用受限的瓶頸。

本課題組通過β-巰基丙酸酯鍵將姜黃素與兩條短鏈PEG連接起來，形成具有典型雙親分子結(jié)構(gòu)的姜黃素衍生物(Curc-OEG)，該衍生物水溶性>50 g·L-1。研究表明，給大鼠200 mg·kg-1灌胃治療，最高血藥濃度0.7 mg·L-1,姜黃素物利用率只有4.13%[5]。但是給予小鼠靜脈注射Curc-OEG 2 mg·kg-1(相當于姜黃素6.25 mg·kg-1)，最高血藥濃度達到6.8mg·L-1，血藥濃度是普通姜黃素灌胃、靜脈注射和腹腔注射的50～500倍，組織分布也顯示姜黃素在肝臟、脾臟及腫瘤組織中含量較高[6]。我們前期的實驗表明，姜黃素衍生物能夠明顯延緩CCl4誘導的大鼠肝纖維化進程，減少I膠原蛋白(collagen Ⅰ)的合成[7]。但姜黃素衍生物發(fā)揮抗纖維化作用是否與其抗炎、抗氧化作用相關(guān)，本課題旨在回答這個問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物60只SD ♂大鼠，SPF級，體質(zhì)量190～220 g，第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)所實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑、儀器 Curc-OEG由浙江大學唐華東教授提供；Curcumin購自上海試劑三廠；高純總RNA提取試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京白泰克生物技術(shù)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)測試盒購自南京建成生物工程研究所； NF-κB 、TNF-α多克隆一抗和多克隆二抗購自Abcam公司；COX-2多克隆一抗購自Santa Cruz公司。β-actin多克隆第一抗體購自北京四正柏生生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程公司合成；RM2235石蠟切片機購自德國萊卡公司；SpectraMax M2多功能酶標儀產(chǎn)自美國。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥 大鼠隨機分為4 組: 正常組(Normal)、模型組(Model)、姜黃素組(Curcumin)、姜黃素衍生物組(Curc-OEG)，每組15 只 。用CCl4誘導大鼠形成肝纖維化模型。除正常組，給予CCl4混合液( CCl4∶橄欖油= 2 ∶3) 皮下注射，每周2次，共8周。第5周開始，正常組和模型組尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml·d-1; 姜黃素組給予Curcumin 400 mg·kg-1·d-1灌胃;姜黃素衍生物組尾靜脈注射Curc-OEG 100 mg·kg-1·d-1。

1.2.2 標本采集 8周后，采心臟血，分離血清，20 ℃保存；取肝右葉同一部位組織，一部分用4%甲醛溶液固定做常規(guī)組織病理學觀察，另一部分用錫箔紙包裹儲存于液氮灌中，用于做定量PCR、MDA、SOD、GSH檢測。

1.2.3 指標檢測 應(yīng)用全自動生化儀器檢測血清ALT、AST含量。各組肝組織用0.9%的生理鹽水制備成10%的勻漿組織，根據(jù)試劑盒說明書檢測MDA、SOD、GSH水平。

1.2.4 肝組織病理學檢查 取肝右葉同一組織部位組織用4%甲醛溶液固定，HE及天狼星紅染色制片[8]，鏡下觀察肝細胞變性、炎癥浸潤、膠原纖維增生程度等組織形態(tài)學變化，用Ishak法對肝臟膠原及纖維化程度進行分級[9]。

1.2.5 Real-time PCR法檢測肝組織中相關(guān)炎癥因子的表達 百泰克試劑盒提取肝組織總RNA。按照TaKaRa RNA PCR試劑盒(AMV)Vcr 3.0說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Premix EX Taq(Perfect Real Time)說明書在ABI7300上進行擴增，檢測NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2四種基因的轉(zhuǎn)錄水平，以GAPDH作為內(nèi)參照。使用的引物序列如下:GAPDH上游: 5′GGCAAATTCAACGGCACAGT-3′，下游:5′-AGATGG TGATGGGCTTCCC-3′。NF-κB上游:5′-TCTGTTTCC CCTCATCTTTCCC-3′，下游:5′-GTCTTAGTGGTTCTG TGCTTCTC- 3′。 IL-1β上游:5′-GTGGTATTCTCCAT GAGCTTTGTA-3′，下游:5′- CCATCTTCTTCTTTGGG TATTGTT- 3′。 IL-6上游 :5′-AACGAAAGTCAACTC CATCTGCC - 3′，下游5′- GGTCTGTTGTGGGTGG TATCCTC- 3′。TNF-α上游:5′-CGCTCTTCTGTC TACTGAACTTC - 3′，下游: 5′- CTGCTTGGTGGTTT GCTACG- 3′。 COX-2上游:5′-CATTCTTTGCCCAGC ACTTCACT- 3′，下游:5′- GATACACCTCTCCACC GATGACC- 3′。

1.2.6 Western blot分析 取各組肝組織100 mg加入1 ml RIPA裂解液中提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%BSA封閉，加入NF-κB(1 ∶2 000) 、TNF-α(1 ∶1 000)，COX-2(1 ∶200)多克隆第一抗體及β-actin(1 ∶3 000)第一抗體，4℃孵育過夜。相應(yīng)HRP標記的第二抗體(1 ∶3 000)室溫孵育1 h，DAB顯影。Quantity One 4.0軟件進行條帶灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 Curc-OEG對大鼠肝纖維化模型血清ALT、AST的影響從Tab1中可見，與正常組比較，CCl4造成明顯的肝損傷，模型組ALT、AST明顯升高(P<0.05)；姜黃素衍生物可以明顯減輕CCl4引起的肝損(P<0.05)，較姜黃素組、姜黃素衍生物組ALT、AST降低明顯(P<0.05)，姜黃素衍生物較姜黃素有更好的護肝降酶作用。

Tab 1 Effect of Curc-OEG on serum ALT，AST in rat hepatic fibrosis model( n=10)

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsmodel；△P<0.05vscurcumin

2.2 Curc-OEG對大鼠肝纖維化模型肝臟組織結(jié)構(gòu)及膠原纖維的影響正常組肝組織肝細胞大小正常，肝索繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整(Fig 1A)，僅在匯管區(qū)和血管壁有少量膠原纖維存在，肝內(nèi)未見纖維組織增生(Fig 2A)；經(jīng)8周造模后，模型組HE染色顯示肝索排列紊亂，可見大片的肝脂肪變性，大量炎性細胞浸潤其中(Fig 1B)，天狼星紅染色可見明顯的紅色CollagenⅠ橋接存在于匯管區(qū)間、匯管區(qū)與中央靜脈間，多見假小葉形成(Fig 2B)；經(jīng)姜黃素治療4周后，姜黃素組肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，可見明顯的細胞脂肪變以及炎性細胞浸潤，CollagenⅠ沿匯管延伸，形成匯管間橋接，可見匯管與中央靜脈橋接(Fig 1C、Fig 2C)；姜黃素衍生物組顯示少量的細胞脂肪變以及炎性細胞浸潤(Fig 1D)，少許CollagenⅠ沿匯管區(qū)延伸，偶見匯管間的橋接，較姜黃素組治療效果更佳(Fig 2D)。肝纖維化按Ishak評分顯示模型組主要分布在F5-F6級，姜黃素組分布在F3-F4級，姜黃素衍生物組分布在F2-F3級。

Fig 1 Effect of Curc-OEG on liver structure in rat hepatic fibrosis model( HE staining,×200)

A: Normal; B：Model; C：Curcumin; D：Curc-OEG

Fig 2 Effect of Curc-OEG on liver collagen in rat hepatic fibrosis model (Sirius red staining of collagens, ×100)

A: Normal; B：Model; C：Curcumin; D： Curc-OEG

2.3 Curc-OEG對大鼠肝纖維化模型肝臟各炎癥因子mRNA表達的影響姜黃素及其衍生物對肝組織炎癥相關(guān)因子的調(diào)控結(jié)果見Fig 3，與正常組相比，模型組NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2mRNA水平明顯升高，其中以COX-2最明顯，上調(diào)高達240倍，慢性CCl4損傷引起肝臟明顯的炎癥反應(yīng)(P<0.05)；與模型組對比，經(jīng)姜黃素及衍生物治療4周后， 均明顯抑制肝組織中NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2mRNA表達，其中對COX-2 mRNA表達調(diào)控尤為突出，分別下調(diào)13.2倍和23.5倍(P<0.05)；與姜黃素相比，姜黃素衍生物下調(diào)NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2mRNA分別為1.6倍、1.7倍、2.1倍、2.6倍、1.8倍，姜黃素衍生物較姜黃素有更好的抗炎作用。

2.4 Curc-OEG對大鼠肝纖維化模型肝臟NF-κB、TNF-α、COX-2蛋白表達的影響從Fig 4中可見，與正常組比較，模型組NF-κB、TNF-α、COX-2蛋白表達升高(P<0.05)；較模型組和姜黃素組，衍生物組 NF-κB、TNF-α、COX-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)。該結(jié)果進一步表明，姜黃素衍生物較姜黃素有更好的抗炎作用。

2.5 Curc-OEG對大鼠肝纖維化模型肝臟MDA、SOD、GSH的影響姜黃素被廣泛認為通過清除活性氧自由基發(fā)揮抗過氧化作用，改善肝細胞氧化還原狀態(tài)[10]，在此我們考察了姜黃素及衍生物對肝臟MDA、GSH和SOD水平的影響，結(jié)果見Fig 5，模型組較正常組MDA水平升高、GSH水平降低、SOD活性降低(P<0.05)；經(jīng)姜黃素及衍生物治療后MDA水平降低、GSH水平升高、SOD活性升高(P<0.05)；姜黃素衍生物組較姜黃素組改變更為明顯(P<0.05)，因而顯示姜黃素衍生物具有更好的抗氧化作用。

3 討論

目前抗肝纖維化的治療主要是通過抗病因治療，尚無特效的藥物治療。近年來，傳統(tǒng)中藥治療對肝纖維化及肝硬化取得一些進展，臨床上常用的中藥有丹參顆粒、扶正化瘀方、鱉甲軟肝片等，但其作用機制至今不明[11]，因此對新型抗纖維化藥物的尋找至今未曾停下。在肝纖維化形成和進展的過程中，HSC是產(chǎn)生ECM的主要來源，各類炎癥因子、趨化因子及氧化應(yīng)激都可以激活HSC，它們在肝纖維化的形成中起著重要作用[12-13]。在Fu等[14]的研究中運用CCl4誘導的大鼠肝纖維化為模型，給予姜黃素治療4周后大鼠血清中ALT、AST、ALP、TNF-α、IL-6和IFN-γ的水平明顯降低，同時肝臟中GSH的水平也升高，明顯延緩大鼠的肝纖維化進程。Chen等[15]的研究證明，姜黃素可能通過降低TLR4的表達和抑制ERK活化從而抑制NF-κB的活化，進而減少活化HSC中結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達。這表明姜黃素可以通過抗炎作用發(fā)揮抗纖維化作用，因為大量證據(jù)也表明CTGF是HSC活化過程中的中心環(huán)節(jié)。此外還有研究表明，姜黃素可以明顯減少活化HSC細胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS的生成，這與它通過促進谷氨酸-半胱氨酸連接酶的活性和促進GSH的合成有關(guān)，而且細胞內(nèi)GSH合成增多可以明顯抑制HSC的活化[16]。這些發(fā)現(xiàn)對于表明姜黃素通過抗氧化作用發(fā)揮抗纖維化作用有著重大意義。

Fig 3 Effect of Curc-OEG on liver cytokines mRNA expression in rat hepatic fibrosis model

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vscurcumin

Fig 4 Effect of Curc-OEG on liver NF-κB，TNF-α， COX-2 protein expression in rat hepatic fibrosis model

A: Normal; B：Model; C：Curcumin; D： Curc-OEG

但是姜黃素始終受到低生物利用度的限制，目前提高姜黃素生物利用度是國內(nèi)外學者研究的熱點。將姜黃素包裹在各種納米粒、脂質(zhì)體、微球中的劑型改變也取得很大進展，如聚乙二醇單丙烯酸脂和姜黃素聚合形成納米姜黃素(Nano Curc TM)被證實較姜黃素有更高的水溶性，可以通過減少炎癥因子(TNF-α、IL-6等)的釋放和抑制HSC的活化，從而延緩CCl4誘導的小鼠肝纖維化進程[17]，但是該納米姜黃素的負載物穩(wěn)定性較差，藥物負載率有待考量、藥物負載物與負載物之間也有可能各不相同[6]。

Fig 5 Effect of Curc-OEG on liver MDA,SOD,GSH in rat hepatic fibrosis model

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vscurcumin

本研究比較了姜黃素和新型雙親Curc-OEG在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中的抗纖維化效果，發(fā)現(xiàn)Curc-OEG具有更好的保肝降酶作用，可能與姜黃素衍生物能更好的提高GSH的水平有關(guān)。肝臟病理學顯示，Curc-OEG比姜黃素能更有效地減輕肝脂肪變和炎癥反應(yīng)，減少CollagenⅠ(其是ECM 沉積中的重要成分)的生成，進而延緩肝纖維化的進程。我們還發(fā)現(xiàn)Curc-OEG較姜黃素明顯減少脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，通過提高GSH水平和SOD活性有效地降低氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生的氧自由基等物質(zhì)，控制機體對氧化應(yīng)激的損傷程度。同時Curc-OEG較姜黃素明顯下調(diào)各炎癥因子 mRNA及蛋白的表達，特別是對COX-2 mRNA的調(diào)控尤為明顯，這可能與姜黃素衍生物發(fā)揮抗纖維化作用密切相關(guān)。因為有報道顯示，靜止的HSC并不表達COX-2，但是活化的HSC卻表達，COX-2-前列腺素信號路徑參與肝纖維化的形成[18]。因此，我們擬將進一步在體內(nèi)外實驗中探討Curc-OEG是否是通過抗炎及抗氧化作用，抑制HSC活化進而發(fā)揮其抗纖維化作用以及其可能的機制。

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The amphiphilic curcumin derivative attenuates liver fibrosis by anti-inflammatory and antioxidant effect

HUANG Xiao-hua1, SUN Yong1, SHEN Neng2, TANG Hua-dong3, REN Hong1, PENG Ming-li1

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiologyofInfectiousDisease,ChongqingUniversityofMedicalScience,Chongqing400010,China;2.ChongqingCancerInstitute,Chongqing400030,China; 3、ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China)

Aim To investigate the effects of anti-in-flammation and antioxidation of an amphiphilic curcu-min derivative (Curc-OEG) on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats. Methods Rats were randomly divided into four groups: control group,model group,curcumin and Curc-OEG treatment group. All rats except those in control group were given subcutaneous injection of CCl4and olive oil mixture, twice a week for 8 weeks. After 4 weeks, rats of control and model group were treated with normal saline intravenously, curcumin group were administered with curcumin 400 mg.kg-1.d-1by gavage and Curc-OEG group were treated with Curc-OEG 100 mg.kg-1.d-1intravenously respectively. After 4 weeks treatment, the serum levels of ALT and AST were tested. HE and Sirus staining were used to evaluate the extent of liver inflammation and fibrosis. The mRNA expression levels of proinflammatory cytokines of NF-kB, IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2 were observed with Real Time PCR. The level of MOD, SOD and GSH in liver of rats were quantified. Results The levels of ALT in control, model, curcumin and Curc-OEG group was (31.7±8.7) U·L-1, (383.0±75.6) U·L-1, (406.3±204.7) U·L-1, (107.0±73.7) U·L-1respectively; that of AST was (137.7±32.7) U·L-1, (585.3±36.7) U·L-1, (485.0±246.5) U·L-1, (202.7±56.0) U·L-1respectively, Curc-OEG possessed more hepatoprotective effects than that of curcumin. Liver pathology showed Curc-OEG treatment could significantly alleviate steatosis, reduce inflammation and apparently suppress hepatic fibrogenesis by reducing the thickness of bridging fibrotic septa. Compared with curcumin, Curc-OEG down-regulated mRNA and protein expression levels of NF-kB, IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2(P<0.05). Moreover, Curc-OEG reduced the level of MOD and increased the levels of SOD and GSH. Conclusion Curc-OEG could more significantly protect the rat liver from CCl4-caused fibrogenesis by anti-inflammatory and antioxidant effect than curcumin.

curcumin; intragastric administration;derivative; intravenous;fibrosis; anti-inflammatory; antioxidant

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.015.html

2014-12-05,

2015-01-15

國家自然科學基金資助項目(No 30771921)

黃小華(1987-)，女，碩士生，研究方向：肝纖維化的藥物研究，E-mail:huangxianiboy@163.com; 彭明利(1972-)，女，副研究員，碩士生導師，研究方向：肝纖維化發(fā)病機制與藥物開發(fā),通訊作者，E-mail:pengmingli@cqmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.007

A

1001-1978(2015)04-0470-06

R-332；R284.1；R322.47；R329.24；R452；R575.205.31