王全富, 藺一飛, 苗 苗, 史永磊, 韓 涵, 吳瑩瑩, 楊 洋, 侯艷華

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

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海冰微生物Pseudoalteromonassp.ANT319耐鹽性初步研究

王全富§, 藺一飛§, 苗 苗, 史永磊, 韓 涵, 吳瑩瑩, 楊 洋, 侯艷華*

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

南極海冰微生物在適應(yīng)極端環(huán)境的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，獲得了特殊的生理生化特性和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。為了更多的了解南極微生物的逆境適應(yīng)機(jī)制，以隸屬南極海冰微生物典型菌屬Pseudoalteromonas的ANT319為研究對(duì)象，探討了該菌株在3%～12%的鹽度梯度下的抗鹽生長(zhǎng)情況、蛋白質(zhì)含量變化、細(xì)胞膜透性、丙二醛含量變化和不同鹽度對(duì)菌株細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)3種抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，此菌株的最適生長(zhǎng)鹽度為9%，隨著鹽度的升高，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量升高，膜透性逐漸增加，SOD和POD的酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在9%鹽度下達(dá)到最高，CAT活性和MDA則基本上保持不變?？梢?jiàn)，隨著鹽度的增加，細(xì)胞膜逐漸受到破壞，同時(shí)生物體對(duì)鹽迫作出應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生較多蛋白來(lái)清除不良因素下產(chǎn)生的有害活性氧，包括生物體內(nèi)抗氧化酶在內(nèi)的蛋白含量及其活性的增加，研究結(jié)果初步揭示了海冰細(xì)菌的耐鹽機(jī)制。

南極；Pseudoalteromonassp.ANT319；耐鹽性；海冰

為了及時(shí)清理體內(nèi)的氧自由基，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)抗氧化酶系統(tǒng)以清除或降低活性氧來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)正常的新陳代謝。生物體內(nèi)重要的抗氧化酶有3種：超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)，它們?cè)谧钸m生長(zhǎng)狀態(tài)下含量極少，逆境時(shí)會(huì)明顯增加以清除體內(nèi)的自由基，這些指標(biāo)的測(cè)定對(duì)耐鹽性鑒定有著重要的作用。丁燏等[4]通過(guò)對(duì)南極冰藻(Chlamydomonassp.ICE)的適冷性研究證明，膜透性、MDA和POD對(duì)南極微藻的逆境生存研究有很好的指示作用。據(jù)報(bào)道，研究人員相繼從南極微生物Aliivibriosalmonicida、Pseudoalteromonashaloplanktis和Bacillussp.中分離到低溫抗氧化酶SOD和CAT，這些研究進(jìn)一步證實(shí)南極微生物的適應(yīng)機(jī)制與其抗氧化性密切相關(guān)[5,6]。南極微生物是一個(gè)潛在的、重要的抗逆基因資源庫(kù)，對(duì)其抗逆機(jī)理相關(guān)報(bào)道較少，本文從總蛋白質(zhì)、膜透性、丙二醛含量及抗氧化酶等方面對(duì)南極海冰細(xì)菌Pseudoalteromonassp.(P.sp.)ANT319的高鹽適應(yīng)性進(jìn)行了初步探討，以期為南極微生物逆境生長(zhǎng)的生理生化適應(yīng)機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用菌株P(guān).sp.ANT319為2001年10月第18次南極科學(xué)考察采集的南極海冰(68°30′E,65°00′S)中分離純化所得。

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，過(guò)濾海水定容至1.0 L，pH 7.5；改良發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl濃度分別為3%、6%、9%和12%的2216E培養(yǎng)基。2216E培養(yǎng)基鹽度按3.3%(w/V)NaCl計(jì)算。

1.2 菌株生長(zhǎng)情況測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株生長(zhǎng)情況的研究分為A、B兩組。其中，A組是直接把菌株培養(yǎng)在不同鹽度的發(fā)酵培養(yǎng)基中，160 r/min，12oC連續(xù)振蕩培養(yǎng)4 d；B組則是先讓菌株在2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d(12℃，160 r/min)，然后加入適量的NaCl使其最終鹽濃度等于A組中對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基的鹽濃度，再繼續(xù)培養(yǎng)2 d，測(cè)定OD600。每組設(shè)3%、6%、9%和12% 4個(gè)鹽度梯度。

1.3 酶液提取

將培養(yǎng)4 d后的菌液離心并稱量濕重。取菌體沉淀于預(yù)冷的研缽中，加入適量的二氧化硅粉末，用少量預(yù)冷的50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.8)在冰浴中研磨10 min后放入-20℃反復(fù)凍融和超聲破碎處理，離心取上清液測(cè)其體積。上清液為多種酶的混合物，4℃保存，用于SOD、CAT和POD的酶活測(cè)定。

1.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[7,8]。

1.5 細(xì)胞膜透性測(cè)定

細(xì)胞膜透性采用黃學(xué)林等[9]的電導(dǎo)率法測(cè)定。

1.6 MDA含量測(cè)定

MDA含量的測(cè)定采用改進(jìn)后的硫代巴比妥酸法[10]。以硫代巴比妥酸溶液(濃度為0.5%)作為空白對(duì)照，紫外分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光值。按155 mmol/cm消光系數(shù)計(jì)算MDA的含量。

1.7 SOD、POD和CAT活性測(cè)定

SOD的活性測(cè)定參照氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[11]，SOD活性單位(U/g)以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位(U)；POD活性參照愈創(chuàng)木酚顯色法[10]，活性單位(U/g·min)以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活單位(U)；CAT活性的測(cè)定參照紫外吸收法[11]。以1 min內(nèi)A240降低0.1的酶量作為CAT的1個(gè)酶活單位(U)，具體反應(yīng)體系見(jiàn)表1～3。

表1 SOD活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)Table 1 Enzyme assay of SOD.

表2 紫外吸收法測(cè)定CAT活性Table 2 Enzyme assay of CAT by UV.

表3 愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性Table 3 Enzyme assay of POD by o-methoxyphenol.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度下菌株的生長(zhǎng)情況

耐鹽菌P.sp.ANT319在不同鹽度下的生長(zhǎng)情況如圖1所示。可以看出：提前加鹽時(shí)，6%和9%鹽度下，P.sp.ANT319的生長(zhǎng)趨勢(shì)良好，OD值一直保持在較高水平，變化幅度不大；3%和12%培養(yǎng)時(shí)，菌體的生長(zhǎng)符合遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的變化規(guī)律。說(shuō)明該菌株的最適生長(zhǎng)鹽度在6%～9%之間，高于或低于此條件培養(yǎng)，菌體都要經(jīng)歷調(diào)整階段才能開(kāi)始生長(zhǎng)，且最高生長(zhǎng)量都不及其余兩個(gè)鹽度高。B組未加鹽時(shí)，菌體生長(zhǎng)一致，都經(jīng)歷了調(diào)整期與對(duì)數(shù)期，說(shuō)明3%鹽度不是其最適培養(yǎng)條件。增加鹽濃度時(shí)，菌株受逆境因素的影響，死亡率大于生長(zhǎng)率，菌體數(shù)量都會(huì)不同程度的減少，且6%和9%時(shí)菌體恢復(fù)生長(zhǎng)的速率較高，進(jìn)一步證明耐鹽菌P.sp.ANT319在6%～9%這個(gè)鹽度區(qū)間內(nèi)能較好的生長(zhǎng)，其自然生境的鹽度也應(yīng)該在此范圍內(nèi)。菌株的生長(zhǎng)情況與海冰細(xì)菌能耐受鹽度急劇變化的觀點(diǎn)相符[12]，當(dāng)外界鹽度驟然變化時(shí)，海冰細(xì)菌會(huì)通過(guò)自身耐鹽機(jī)制的調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)環(huán)境使之恢復(fù)生長(zhǎng)。

2.2 不同鹽度下培養(yǎng)菌體的濕重

菌體的濕重能從側(cè)面反映出菌體的生長(zhǎng)情況。提前加鹽和后加鹽兩組處理后，耐鹽菌P.sp.ANT319在不同鹽度下的濕重見(jiàn)圖2A。從圖中可以看出，無(wú)論是提前加鹽還是培養(yǎng)2 d后加鹽，6%和9%鹽度時(shí)，菌體的生長(zhǎng)情況都較其他兩組較好，即P.sp.ANT319的最適生長(zhǎng)鹽度為6%～9%，與2.1所得出的結(jié)論一致。從整體來(lái)看，提前加鹽較后加鹽的生長(zhǎng)情況好，證明鹽度的突然增加會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)。

2.3 不同鹽度下培養(yǎng)菌株的蛋白質(zhì)含量

從圖2B可以看出：提前加鹽比后加鹽蛋白質(zhì)含量高。提前加鹽和后加鹽組，耐鹽菌P.sp.ANT319在9%最適生長(zhǎng)鹽度下的蛋白含量都處于最高值，可能是因?yàn)榇他}度下菌體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，合成分泌較多與耐鹽相關(guān)的活性酶，為海冰細(xì)菌適應(yīng)不良生境提供保障。高于或低于此鹽度，蛋白質(zhì)含量都會(huì)有所下降，且以12%時(shí)下降最多，說(shuō)明該菌株不能在此鹽度下產(chǎn)生較多調(diào)節(jié)蛋白，從而使菌體生長(zhǎng)受到活性氧的損害。

圖1 菌株P(guān).sp.ANT319在不同鹽度下的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of P.sp.ANT319 in different salinity.

圖2 菌株P(guān).sp.ANT319在不同鹽度下的濕重(A)和蛋白質(zhì)含量(B)Fig.2 Wet weight (A) and proteins contents (B) of P.sp.ANT319 in different salinity.

2.4 不同鹽度下培養(yǎng)菌株細(xì)胞膜透性

不同鹽度下培養(yǎng)的菌株的膜透性變化見(jiàn)圖3A?？梢钥闯?，無(wú)論是保持鹽濃度恒定還是使鹽濃度驟然增加，隨著鹽濃度的升高，細(xì)胞膜的透性都會(huì)逐漸增加。但是后加鹽的滲透率變化較提前加鹽明顯，這是因?yàn)辂}濃度驟然增加時(shí)，菌株正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新合成的細(xì)胞膜對(duì)外界環(huán)境的突然變化反應(yīng)較為強(qiáng)烈。細(xì)胞膜透性是細(xì)胞膜受傷害程度的最直接反映。

2.5 不同鹽度下培養(yǎng)菌株的MDA含量變化

不同鹽度培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)的MDA含量見(jiàn)圖3B?？梢钥闯?，提前加鹽時(shí)，MDA含量變化很小；后加鹽時(shí)，在3%～9%鹽度下，MDA的濃度基本上保持穩(wěn)定，只有在12%較高鹽度下，MDA的濃度才有所升高，但值也不是很大。說(shuō)明此菌株的脂質(zhì)過(guò)氧化程度較低，細(xì)胞受損程度較小，可能是由于菌體內(nèi)的抗氧化酶發(fā)揮協(xié)同作用，及時(shí)地將活性氧基團(tuán)轉(zhuǎn)化成了對(duì)機(jī)體無(wú)害的物質(zhì)。

圖3 不同鹽度下細(xì)胞膜透性(A)和細(xì)胞內(nèi)的MDA含量(B)Fig.3 Cell cytoplasm membrane permeation (A) and MDA contents (B) of P.sp.ANT319 in different salinity.

2.6 不同鹽度下培養(yǎng)菌株的SOD活性

從圖4A可以看出，兩種不同培養(yǎng)條件下，在3%～9%范圍內(nèi)，隨著鹽度的增加，SOD的活性也在增加，9%濃度時(shí)，酶活達(dá)到最高值。當(dāng)鹽度為12%時(shí)，SOD酶活性下降，僅為最高值的60%左右，說(shuō)明鹽濃度在3%～9%之間逐漸增加時(shí)，SOD的活性也相應(yīng)增加以維持體內(nèi)的氧自由基在較低水平，到9%時(shí)，酶活性達(dá)到最高。當(dāng)鹽度高達(dá)12%時(shí)，由于細(xì)胞膜通透性變大，氧自由基大量增加，SOD酶活性較低，不能及時(shí)將其轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體受損，生長(zhǎng)緩慢。

2.7 不同鹽度下培養(yǎng)菌株的CAT活性

CAT與SOD協(xié)同作用，能將SOD產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，降低活性氧基團(tuán)對(duì)細(xì)胞膜的傷害，是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物酶之一。從圖4B中可以看出，兩種不同條件培養(yǎng)時(shí)，不同鹽度下，P.sp.ANT319的CAT活性基本上保持不變，全部處于0.51～0.57 U/g·min之間。對(duì)細(xì)胞內(nèi)增加的活性氧基團(tuán)的清除沒(méi)有明顯作用。

2.8 不同鹽度下培養(yǎng)菌株的POD活性

提前加鹽和后加鹽的POD活性變化見(jiàn)圖4C，可以看出，兩種不同培養(yǎng)條件下，P.sp.ANT319的POD活性都是先升高后降低的變化趨勢(shì)，活性規(guī)律與SOD一致。說(shuō)明在受到外界環(huán)境突然刺激時(shí)，POD能及時(shí)的將SOD產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為對(duì)機(jī)體無(wú)害的物質(zhì)。

圖4 不同鹽度下細(xì)胞內(nèi)的SOD(A)、CAT(B)和POD(C)活性Fig.4 Enzymatic activity of SOD(A),CAT(B) and POD(C) of P.sp.ANT319 in different salinity.

3 討論

本研究結(jié)果表明，海冰細(xì)菌P.sp.ANT319的最適生長(zhǎng)鹽度為9%，隨著鹽度的升高，細(xì)胞所處環(huán)境的滲透壓逐漸增大，細(xì)胞膜成分和結(jié)構(gòu)完整性被破壞，膜透性逐漸增加，同時(shí)生物體對(duì)逆境作出應(yīng)答，產(chǎn)生較多的調(diào)節(jié)蛋白以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，繼而表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量升高。其他研究也指出不良因素會(huì)引起蛋白質(zhì)含量升高。如Tenivi等[13]發(fā)現(xiàn)4種暴露于增強(qiáng)的UV-B輻射中的植物，其可溶性蛋白增加，可能是由于該菌合成了大量抗紫外輻射傷害的功能性蛋白。王征宏等[14]發(fā)現(xiàn)，在NaCl脅迫下，玉米芽和玉米根內(nèi)可溶性蛋白含量分別增高了29.17%和23.33%，這是由于可溶性蛋白具有較強(qiáng)的親水膠體性質(zhì)，影響著細(xì)胞的保水力，細(xì)胞通過(guò)可溶性蛋白的積累來(lái)降低滲透勢(shì)，從而減少由NaCl脅迫所造成的環(huán)境滲透壓改變對(duì)生物體的傷害。

在一些植物的耐鹽性研究中發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度的升高，MDA的含量也隨之升高，主要是因?yàn)榭寡趸覆荒芗皶r(shí)地清除氧自由基[15]，如趙風(fēng)斌等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在0.05 mol/L鹽脅迫使3種沉水植物的MDA含量提高， 而本文中MDA含量基本保持不變，說(shuō)明生物體通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)，對(duì)鹽度脅迫作出了很好的應(yīng)答，保護(hù)了脂類物質(zhì)免受氧化損傷。本研究中隨著鹽度的增加，SOD和POD的酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，CAT活性基本上保持不變?？梢?jiàn)在P.sp.ANT319應(yīng)對(duì)氧化脅迫中，POD協(xié)同SOD發(fā)揮著主要的抵御作用，保護(hù)機(jī)體的生長(zhǎng)。POD是否在抗氧化酶系統(tǒng)中占據(jù)主要的作用與物種有很大的關(guān)聯(lián)。劉長(zhǎng)仲等[17]的研究表明受到環(huán)境脅迫的細(xì)胞會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)增加SOD的活性從而抵御傷害；Zhang和Nan[18]的研究結(jié)果證明SOD能提高耐鹽性。劉愛(ài)榮等[19]在金盞菊的研究中發(fā)現(xiàn)，鹽濃度增加時(shí)CAT的活性減弱。這兩種情況都可能是機(jī)體內(nèi)其他的抗氧化酶發(fā)揮主導(dǎo)作用協(xié)同SOD變化所致。史雨剛[20]在對(duì)不同品種高粱幼苗鹽脅迫研究中指出，高粱幼苗 21A×R208、6A×R308 隨鹽脅迫的加劇POD活性先升高而后下降；而7A×R301、晉雜12則隨鹽脅迫的加劇POD活性逐漸下降；晉雜17 POD活性則表現(xiàn)為先下降而后升高。這也揭示了CAT和POD共同協(xié)同SOD發(fā)揮抗氧化作用的過(guò)程中，對(duì)于不同的生物體，發(fā)揮主導(dǎo)作用的酶不同。這些指標(biāo)變化規(guī)律初步揭示了菌株P(guān).sp.ANT319的耐鹽機(jī)制，為生物適應(yīng)機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。

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Preliminary Study on Salt Tolerance of Sea-ice MicroorganismPseudoa-lteromonassp.ANT319

WANG Quan-fu§,LIN Yi-fei§,MIAO Miao,SHI Yong-lei,HAN Han,WU Ying-ying,YANG Yang,HOU Yan-hua*

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

Over long periods of evolution,Antarctic sea-ice microorganisms obtained special physiological and biochemical characterristics and gene expression regulation mechanisms to adapt extreme environment.To learn more about the adaption mechanism of the Antarctic microorganisms,the strain’s growth,total protein content,permeability of cell membrane,malondialdehyde and antioxidant enzymes system activity including SOD,POD and CAT had been studied under different salinity conditions of 3%～9% based on thePseudoalteromonassp.ANT319,which belongs to the typical genus in Antarctic bacteria.The results showed that the optimum salinity forP.sp.ANT319 was 9%.With salinity increasing,the total protein content and membrane permeability increased while SOD and POD enzymatic activities presented a trend of increasing firstly with the highest at 9% and then decreasing later,meanwhile CAT activity and MDA kept steady.Therefore,as the salinity increased,total proteins content increased as result of cell membranes damaged gradually,meanwhile,the strain produced more proteins to remove harmful reactive oxygen species caused by salt stress and the activities of antioxidant enzymes were also enhanced.These results revealed the salinity tolerance mechanism of sea-ice bacteria preliminarily.

Antarctic;Pseudoalteromonassp.ANT319; salt tolerance; sea-ice

2015-03-20; 接受日期：2015-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100037)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2011CM003)資助。

王全富與藺一飛為本文共同第一作者。王全富，副教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境微生物學(xué)。E-mail：wangquanfu2000@126.com；藺一飛，碩士研究生，研究方向海洋環(huán)境微生物學(xué)。E-mail: 657904059@qq.com。*通信作者：侯艷華，副教授，博士，研究方向?yàn)闃O端環(huán)境微生物。E-mail：marry7718@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.15