肖 偉, 閆培生

哈爾濱工業(yè)大學(威海)海洋科學與技術(shù)學院,山東 威海 264209

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海帶渣微生物藥肥對土壤中產(chǎn)毒真菌寄生曲霉的抑制作用研究

肖 偉, 閆培生*

哈爾濱工業(yè)大學(威海)海洋科學與技術(shù)學院,山東 威海 264209

研究了施用多功能生防芽孢桿菌Hitwh-BA2菌株發(fā)酵生產(chǎn)的海帶渣微生物藥肥對栽培土壤中產(chǎn)毒真菌寄生曲霉的生態(tài)防治效果。結(jié)果表明：施用海帶渣微生物藥肥能極顯著的降低栽培土壤中寄生曲霉的數(shù)量水平，有效降低寄生曲霉占總真菌數(shù)的百分含量，其作用效益優(yōu)于海帶渣；施用海帶渣微生物藥肥能極顯著提高栽培土壤中細菌的數(shù)量水平，作用效果極顯著優(yōu)于海帶渣。研究結(jié)果期望為土壤黃曲霉毒素產(chǎn)毒真菌的防控提供參考。

海帶渣微生物藥肥；海帶渣；寄生曲霉；生態(tài)防治

在環(huán)境有害微生物生態(tài)防治體系中，植物病害可以看成是植物所處的生物因素和非生物因素相互作用的生態(tài)系統(tǒng)失衡所致，因此植物病害的生態(tài)防治就是通過各種措施來實現(xiàn)植物所處的生物因素與非生物因素平衡的重建，最終將病原微生物種群的數(shù)量與危害性控制在經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益允許的閾值之內(nèi)，確保植物生態(tài)系統(tǒng)群體的健康發(fā)展。這與傳統(tǒng)的對于環(huán)境中植物病害的化學防治所期望的“鏟除”的作用效果是不同的。

花生是我國重要的油料作物，其總產(chǎn)量居我國油料作物之首。黃曲霉是花生生產(chǎn)過程中最主要的產(chǎn)毒真菌，嚴重威脅著花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，其中黃曲霉毒素B1被世界衛(wèi)生組織列為1類致癌物[1]。黃曲霉毒素的污染危害已嚴重影響了我國花生的生產(chǎn)、食用安全和出口創(chuàng)匯。對于花生生產(chǎn)過程中黃曲霉侵染的生態(tài)防治過程，可以這樣認為：從花生與花生所處的微生態(tài)環(huán)境出發(fā)，通過對花生生長環(huán)境中生物因素與非生物因素進行調(diào)控，增強花生自身抗黃曲霉侵染的能力[2～5]，增加土壤微生態(tài)環(huán)境中有益微生物的數(shù)量，提高土壤自身的抑菌能力，降低土壤中產(chǎn)黃曲霉毒素病害真菌的數(shù)量水平，從而對花生黃曲霉污染進行有效防治。

施用有機菌肥是植物病害生態(tài)防治的重要手段。有機菌肥是有機質(zhì)與有益菌的有效結(jié)合體，兼具兩者的某些特性。其中以有益菌特別是植物病原微生物拮抗菌為研究對象的生物防治手段是植物病害生態(tài)防治的重要組成部分[6]；而其中的有機質(zhì)，特別是無害的工農(nóng)業(yè)固體廢棄物用于有機菌肥的生產(chǎn)，是這些有機廢棄物資源化利用的主要途徑[7]。

地球上四分之三的面積是海洋，我國是一個海洋大國，隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，海洋戰(zhàn)略已經(jīng)上升為我國的國家戰(zhàn)略，我國加快了對海洋資源開發(fā)利用的腳步。海洋中大量的海藻資源對于人類而言是巨大而寶貴的財富。海帶渣是海帶加工過程中最大宗的固體廢棄物，其主要成分為海藻纖維、蛋白質(zhì)、海藻多糖、殼聚糖、多酚和甜菜堿等，并且還含有大量的堿性金屬離子[8,9]。傳統(tǒng)處理海帶渣的主要方式是衛(wèi)生填埋，但這種方式不僅造成了土壤資源的浪費，更浪費了海帶渣中未被利用的有機質(zhì)成分。因此圍繞海帶渣(海藻)的資源化利用，科研工作者們展開了廣泛的研究。在海帶渣綜合利用方面，一般主要集中在飼料添加劑[10]、有機肥[11]、膳食纖維原料[12～14]、酸性土壤調(diào)節(jié)劑[9]，以及作為基質(zhì)用于生產(chǎn)燃料乙醇等[15，16]。利用海帶渣以及海藻進行有機菌肥的生產(chǎn)具有廣闊的前景。本實驗通過盆栽方式對施用海帶渣微生物藥肥防控產(chǎn)毒真菌寄生曲霉在土壤中的群體數(shù)量變化進行了初步研究，以期為有效防控作物的黃曲霉毒素污染提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用產(chǎn)毒真菌為寄生曲霉NFRI-95，由日本國家食品研究所提供。該菌株是寄生曲霉的一株突變菌株，其不能產(chǎn)生黃曲霉毒素，但能積累紅色黃曲霉毒素中間產(chǎn)物的norsolorinin acid(NA)，其最適生長pH在6.0左右。盆栽花生品種為花育17，購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，該品種對寄生曲霉的侵染敏感[17]。

1.2 培養(yǎng)基配方

DG18培養(yǎng)基：5.0 g/L蛋白胨，10.0 g/L葡萄糖，1.0 g/L磷酸二氫鉀，0.01 g/L硫酸鋅，0.5 g/L硫酸鎂，0.005 g/L硫酸銅，0.002 g/L氯硝銨，0.05 g/L氯霉素，0.05 g/L鹽酸金霉素，15 g/L瓊脂。

GY固體培養(yǎng)基：20 g/L 葡萄糖，5 g/L酵母粉，20 g/L瓊脂。

1.3 海帶渣微生物藥肥的制備

將試管斜面上的具有廣譜抑制病原真菌生長并且能產(chǎn)生植物生長激素6-KT的生防芽孢桿菌Hitwh-BA2取一環(huán)接種到裝有20 mL GY培養(yǎng)液(含20 g/L葡萄糖和5 g/L酵母粉)的三角瓶中在搖床上培養(yǎng)12 h(35℃，150 r/min)；將海帶渣粉碎至0.5 mm，在培養(yǎng)瓶中裝37.4 g干海帶渣、2.1 g蔗糖、0.5 g KNO3與60 mL去離子水，pH為自然，滅菌，按照4%的接種量將制備好的生物菌母液接種到固體培養(yǎng)基中，在35℃進行固體發(fā)酵8 d，備用。

1.4 盆栽實驗

實驗模擬在土壤被產(chǎn)毒真菌寄生曲霉NFRI-95人工接種浸染的條件下，研究施用海帶渣微生物藥肥對減少土壤中寄生曲霉NFRI-95群體數(shù)量水平和增加土壤中細菌水平的作用。試驗分3個處理組，即：處理組1(對照，不施用海帶渣微生物藥肥與海帶渣)、處理組2(施用20 g海帶渣微生物藥肥)和處理組3(施用20 g海帶渣)?；ㄉ柙匀缦拢簭霓r(nóng)田中取回20 kg左右的花生盆栽用土，去除土壤中的雜質(zhì)使土壤均一。向栽培土中接種寄生曲霉NFRI-95孢子，使寄生曲霉NFRI-95的孢子數(shù)為1×104個孢子/g土壤。實驗采用塑料花盆(直徑230 mm)進行盆栽，每個處理3個花盆，每盆裝土2.1 kg，按照實驗處理組的設計進行分組裝盆，并按照隨機區(qū)組實驗設計進行排列。施入花盆中的海帶渣微生物藥肥或海帶渣與花盆中的土壤充分混勻。盆栽準備完畢后進行花生種子的播種，每個處理組播種30粒(10粒/盆)，采用穴播的方式，播種深度為5 cm左右?；ㄉ雒绾髮ε柚械幕ㄉM行間苗，每盆保留4株花生。

1.5 土壤中微生物數(shù)量的測定

土壤中寄生曲霉NFRI-95與總真菌數(shù)的測定：實驗選擇DG18培養(yǎng)基來進行各個時期花生栽培土壤樣本中寄生曲霉NFRI-95和總真菌數(shù)的測定。具體操作如下：取不同處理組花生各個時期(苗期A、花期B和收獲期C)根際土壤樣本和根外土壤樣本，并采用稀釋涂平板法對寄生曲霉NFRI-95與總真菌數(shù)進行檢測，即：用無菌水對土壤樣本進行10倍稀釋，取100 μL稀釋液到含有DG-18培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布器進行涂布，每個處理2個重復，28℃條件下培養(yǎng)3～4 d，觀察記錄在DG-18培養(yǎng)基上所生長的寄生曲霉NFRI-95數(shù)與真菌總數(shù)；對各個土壤樣本的含水量進行檢測，用于各個處理組單位土壤中寄生曲霉NFRI-95與總真菌數(shù)的比較。

土壤中細菌數(shù)的測定：實驗選擇GY培養(yǎng)基進行各個時期花生栽培土壤樣本中細菌數(shù)的檢出。具體操作如下：取花生各個時期(苗期A、花期B和收獲期C)不同處理組花生根際土壤樣本和花生根外土壤樣本，并采用稀釋涂平板法對各個土壤樣本中細菌數(shù)進行檢測，即：用無菌水對土壤樣本進行107倍稀釋，取100 μL稀釋液到含有GY培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂布器進行涂布，每個處理2個重復，35℃條件下培養(yǎng)1 d，觀察記錄在GY培養(yǎng)基上所生長的細菌總數(shù)；對各個土壤樣本的含水量進行檢測，用于各個處理組單位土壤中細菌數(shù)的比較。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件對盆栽花生不同時期根外與根際土壤中寄生曲霉NFRI-95、真菌總數(shù)和細菌總數(shù)的實驗數(shù)據(jù)進行比較均值單因素ANOVA的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用海帶渣微生物藥肥對栽培土壤中寄生曲霉與總真菌數(shù)量的影響

不同時期花生盆栽根外土壤與根際土壤中寄生曲霉NFRI-95與總真菌數(shù)的檢測結(jié)果分別見表1和表2。

結(jié)果表明，苗期施用海帶渣微生物藥肥能極顯著的降低根際外土壤中寄生曲霉NFRI-95的數(shù)量水平，施用海帶渣微生物藥肥的作用效果優(yōu)于海帶渣，但兩者之間差異不顯著；施用海帶渣微生物藥肥與施用海帶渣對于根際外土壤中真菌總數(shù)的影響并不顯著?；ㄆ谑┯煤г⑸锼幏誓軜O顯著的降低根際外土壤中寄生曲霉NFRI-95的數(shù)量水平；施用海帶渣微生物藥肥的作用效果優(yōu)于海帶渣，兩者之間差異極顯著；施用海帶渣微生物藥肥與施用海帶渣對于根際外土壤中真菌總數(shù)的影響不顯著。收獲期施用海帶渣微生物藥肥能顯著降低根際外土壤中寄生曲霉NFRI-95的數(shù)量水平，施用海帶渣微生物藥肥的作用效果優(yōu)于海帶渣，兩者之間差異顯著；同時這一時期施用海帶渣微生物藥肥能極顯著的增加栽培土壤中的真菌總數(shù)。

表1 根外土壤樣本中寄生曲霉NFRI-95與總真菌數(shù)的檢測結(jié)果Table 1 The number of A.parasiticus NFRI-95 and total fungi outside rhizosphere soil sample.

注：A為苗期，B為花期，C為收獲期。1,2,3為不同的處理組。每個處理組以同一時期的處理組1為對照，*表示在P<0.05水平上差異顯著，**表示P<0.01水平上差異顯著。

表2 根際土壤樣本中寄生曲霉NFRI-95與總真菌數(shù)的檢測結(jié)果Table 2 The number of A.parasiticus NFRI-95 and total fungi in rhizosphere soil sample.

注：A為苗期，B為花期，C為收獲期。1,2,3為不同的處理組。每個處理組以同一時期的處理組1為對照，*表示在P<0.05水平上差異顯著，**表示P<0.01水平上差異顯著。

從實驗的結(jié)果看：施用海帶渣微生物藥肥能極顯著的降低栽培土壤中產(chǎn)毒真菌寄生曲霉NFRI-95的數(shù)量水平，施用海帶渣微生物藥肥的作用效果優(yōu)于海帶渣。除收獲期外，施用海帶渣微生物藥肥和施用海帶渣對于栽培土壤的真菌總數(shù)的數(shù)量水平影響并不大。

2.2 施用海帶渣微生物藥肥對栽培土壤中細菌數(shù)量水平的影響

不同時期花生盆栽根際外土壤與根際土壤中細菌數(shù)的檢測結(jié)果如表3。

表3 栽培土壤中細菌數(shù)的檢測Table 3 The number of bacteria in soil sample.

注：A為苗期，B為花期，C為收獲期。1,2,3為不同的處理組。每個處理組以同一時期的處理組1為對照，*表示在P<0.05水平上差異顯著，**表示P<0.01水平上差異顯著。

結(jié)果表明，在不同時期根際外土壤與根際土壤中細菌數(shù)具有相似的變化趨勢，與對照相比，施用海帶渣微生物藥肥與海帶渣均能極顯著的增加栽培土壤中細菌的數(shù)量水平；且施用海帶渣微生物藥肥的作用效果優(yōu)于施用海帶渣的作用效果，兩者之間差異極顯著。

3 討論

從栽培土壤中寄生曲霉NFRI-95與真菌的數(shù)量水平隨栽培時間的變化趨勢看，寄生曲霉NFRI-95的數(shù)量水平與占土壤中總真菌數(shù)的百分含量總體呈現(xiàn)降低的趨勢?；ㄉ斋@期根際外土壤樣品中，未施用海帶渣微生物藥肥與海帶渣的處理組中寄生曲霉NFRI-95數(shù)占真菌總數(shù)的47.9%；施用海帶渣微生物藥肥處理組中的寄生曲霉NFRI-95數(shù)占真菌總數(shù)的9.4%；施用海帶渣處理組中的寄生曲霉NFRI-95數(shù)占真菌總數(shù)的25.2%。花生收獲期時根際土壤樣品中，未施用海帶渣微生物藥肥與海帶渣的處理組中寄生曲霉NFRI-95數(shù)占真菌總數(shù)的62.5%；施用海帶渣微生物藥肥處理組中的寄生曲霉NFRI-95數(shù)占真菌總數(shù)的17.6%；施用海帶渣處理組中的寄生曲霉NFRI-95數(shù)占真菌總數(shù)的24.5%?？梢娛┯煤г⑸锼幏誓苡行У亟档屯寥乐挟a(chǎn)毒真菌寄生曲霉NFRI-95的數(shù)量水平與百分含量，較低的數(shù)量水平降低了寄生曲霉NFRI-95對花生的侵染機會，較低的百分含量有利于其他真菌在土壤中對產(chǎn)毒真菌寄生曲霉NFRI-95形成有效的營養(yǎng)競爭與生態(tài)位競爭，從而有效的控制產(chǎn)毒真菌寄生曲霉NFRI-95對花生的侵染。與此同時，施用海帶渣微生物藥肥極顯著的提高了土壤中細菌的數(shù)量水平，本課題組的前期研究結(jié)果也表明施用海帶渣微生物藥肥能極顯著的提高栽培土壤抑制寄生曲霉NFRI-95活性的能力[18]，這反映了施用海帶渣微生物藥肥后，其內(nèi)的生防芽孢桿菌Hitwh-BA2菌株在土壤中形成了有效定殖，發(fā)揮了對產(chǎn)毒真菌寄生曲霉NFRI-95的防治作用。

[1] IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.Some traditional herbal medicines,some mycotoxins,naphthalene and styrene.Aflatoxins[J].IARC Monogr.Eval.Carcinog Risks Hum.,2002,82:1-556.

[2] 田立榮，廖伯壽，李玉榮，等.花生抗黃曲霉遺傳改良研究進展[J].河北農(nóng)業(yè)科學，2010，14(9)：80-83.

[3] Liao B S，Zhuang W J，Tang R H,etal..Peanut aflatoxin and genomics research in China: Progress and perspectives [J].Peanut Sci.，2009，36：21-28.

[4] Rao K S，Tulpule P G.Varietal differences of groundnut in the production of aflatoxin[J].Nature，1967，214：738-739.

[5] 黎穗臨.廣東花生抗黃曲霉研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2006，10：17-20.

[6] Rana A，Saharan B,Joshi M，etal..Identification of multi-trait PGPR isolates and evaluating their potential as inoculants for wheat[J].Ann.Microbiol.，2011， 61：893-900.

[7] 林朝法，林潮瀾，吳樹業(yè).微生物與化學制劑快速催腐秸稈技術(shù)與應用效果初探[J].中國稻米，2013，19(4)：117-120.

[8] 張俊杰，段 蕊，許 可，等.海帶工業(yè)中海帶渣應用的研究及展望[J].水產(chǎn)科學，2010，29(10)： 620-623.

[9] 張俊杰，段 蕊，趙玉山，等.一種酸性土壤改良劑及其用途[P].中國 101935532 A,2011.

[10] 甘純璣，彭時堯，施木田，等.海帶廢渣處理條件及其在羅非魚飼料中的利用[J].中國環(huán)境科學，1996，16(4)：315-320.

[11] 周 楠，馬 杰，張淑平，等.海帶渣生產(chǎn)有機肥的工藝研究[J].化學工程與裝備，2011，3：11-13.

[12] 樊文樂，武文潔.以提取褐藻糖膠的廢渣制備膳食纖維[J].中國食物與營養(yǎng)，2006，4：42-44.

[13] 謝 苗，王 斌，鄧海燕，等.海帶膳食纖維的制備條件與營養(yǎng)評價[J].河南科技大學學報:農(nóng)學版，2004，4：56-59.

[14] 潘文潔，李明松.海帶膳食纖維不同提取方法的研究[J].安徽工程科技學院學報:自然科學版，2007，22(2)：26-28.

[15] 陳姍姍，藩詩翰，董 蓉，等.褐藻燃料乙醇研究進展及其應用前景[J].中國釀造，2011，4：11-15.

[16] 明凱利，張 梅，王樹春，等.利用海帶渣生產(chǎn)燃料乙醇的初步研究[J].化工進展，2013，32(3)：570-573.

[17] Xiao W，Yan P S.AntagonizingAspergillusparasiticusand promoting peanut growth ofBacillusisolated from peanut geocarposphere soil[J].J.Integ.Agric.,2014,13(11)：2445-2451.

[18] 肖 偉，閆培生.海帶渣菌肥作為土壤添加劑對土壤抑菌活性影響的研究[J].植物營養(yǎng)與肥料學報，2014，20(3)：778-782.

Inhibition Effect of Kelp Residue Microbial Fertilizer on Mycotoxin-producing FungusAspergillusparasiticusin Soil

XIAO Wei,YAN Pei-sheng*

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShangdongWeihai264209,China

The inhibition effect of kelp residue microbial fertilizer on mycotoxin-producing fungusAspergillusparasiticuswas studied.The kelp residue microbial fertilizer was fermented with bio-controlBacillusHitwh-BA2.Results showed that kelp residue microbial fertilizer have extremely significantly reduced the number ofA.parasiticusandA.parasiticuspercentage of total number of fungi,and its effect was better than kelp residue; kelp residue microbial fertilizer have extremely significantly improved the number of bacteria in cultivated soil,and the effect of kelp reside microbial fertilizer and kelp residue were extremely significant difference.The results suggestted that kelp residue microbial fertilizer could be used in biocontrol of aflatoxin-producing fungi in soils.

kelp residue microbial fertilizer; kelp residue;Aspergillusparasiticus; ecological control

2015-03-20; 接受日期：2015-04-16

國家自然科學基金(30870003);威海市科技發(fā)展研究計劃項目(2010-3-96);哈爾濱工業(yè)大學優(yōu)秀團隊支持計劃資助。

肖偉，博士研究生，主要從事植物病理、植物病害的生物防治與生態(tài)防治研究。E-mail：tuerxiao@yeah.net。*通信作者：閆培生，教授，博士生導師，博士，主要從事海洋微生物資源利用、海洋生物質(zhì)及其加工廢棄物的高值資源化、有害微生物的生物防治與生物農(nóng)藥、微生物發(fā)酵工程與生物制藥研究。E-mail：yps6@163.com。

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.11