黃素楠，王 欣，曹建國(guó)，戴錫玲

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

五種鱗毛蕨科植物總黃酮含量及抗氧化活性分析

黃素楠，王 欣，曹建國(guó)，戴錫玲

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

采用鋁鹽顯色分光光度法研究了5種鱗毛蕨科植物的總黃酮含量，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析.結(jié)果表明：所研究的5種鱗毛蕨科植物的總黃酮含量在5%～8%；狹頂鱗毛蕨的總黃酮含量最多（8.24%），其次是半島鱗毛蕨（6.53%）和戟葉耳蕨（5.2%），變異鱗毛蕨（5.01%）和暗鱗鱗毛蕨（5.01%）的總黃酮含量最低；5種鱗毛蕨科植物的黃酮提取液具有良好的抗氧化能力，且提取的黃酮類化合物的添加量在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)與其抗氧化活性（鐵還原力、DPPH自由基清除活性、ABTS+清除活性）呈正相關(guān).為鱗毛蕨科植物資源的開發(fā)利用提供參考.

鱗毛蕨科；總黃酮；抗氧化活性

鱗毛蕨科植物次生代謝產(chǎn)物黃酮類化合物在改善記憶［1］、抗抑郁［2］、抗菌抑菌、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)［3］、抗衰老和抗疲勞、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［4］等方面有廣泛的應(yīng)用，其具有的較強(qiáng)抗氧化活性可能是其發(fā)揮生理功效的藥理基礎(chǔ)［5］.人類為了維持自身的正常運(yùn)轉(zhuǎn)和健康狀態(tài)，抵御各種自由基對(duì)組織的傷害，常需要自身產(chǎn)生或外界補(bǔ)充各種抗氧化劑.食品類抗氧化成分的種類和應(yīng)用有限，合成抗氧化劑已被證實(shí)有致癌作用，安全性受到質(zhì)疑［6］.近年來(lái)，從天然產(chǎn)物中尋找更加安全有效的抗氧化劑，已成為國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多學(xué)者的共同目標(biāo).目前，已對(duì)密果耳蕨、半育耳蕨、有蓋肉刺蕨、聯(lián)合鱗毛蕨、近川西鱗毛蕨、斜方復(fù)葉耳蕨、刺頭復(fù)葉耳蕨、異鱗鱗毛蕨和闊鱗鱗毛蕨等9種鱗毛蕨科植物的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)鱗毛蕨科以外的鐵線蕨、金星蕨、江南星蕨等黃酮提取物的抗氧化活性進(jìn)行了提取研究［7-11］.

鱗毛蕨科植物有1 200余種，我國(guó)472種［12］.半島鱗毛蕨Dryopteris peninsulae分布在遼寧、江西、湖北、云南東北部等地；狹頂鱗毛蕨D.lacera分布在黑龍江、浙江、湖南、四川等地；暗鱗鱗毛蕨D.atrata分布在長(zhǎng)江以南各省區(qū)，東到臺(tái)灣，北到甘肅，西南達(dá)西藏；變異鱗毛蕨D.uaria分布在陜西（佛坪）、江蘇、湖北、廣東等地；戟葉耳蕨Polystichum tripteron廣泛分布于全國(guó)各地［12］.以上5種鱗毛蕨科植物均為廣泛分布的常見(jiàn)種，資源較為豐富.

本研究提取鱗毛蕨科5種植物（半島鱗毛蕨、狹頂鱗毛蕨、暗鱗鱗毛蕨、變異鱗毛蕨和戟葉耳蕨）的總黃酮，并通過(guò)對(duì)其總黃酮提取液的鐵還原力、DPPH自由基清除活性、ABTS+清除活性的測(cè)定，研究其抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)鱗毛蕨科植物的藥用資源積累基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 材 料

5種鱗毛蕨科植物采自浙江西天目山，憑證標(biāo)本保存在上海師范大學(xué)蕨類植物標(biāo)本室.

1.1.2 試 劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自上海生物試劑二廠），NaNO2，Al（NO3）3，NaOH，乙醇，DPPH溶液，K2S2O8，ABTS，醋酸緩沖液，TPTZ，F(xiàn)eCl3溶液，F(xiàn)eSO4溶液，磷酸鈉緩沖液，鐵氰化鉀（購(gòu)自sigma公司）.

1.2 方 法

1.2.1 蕨類植物總黃酮的提取及含量測(cè)定

1.2.1.1 蕨類植物總黃酮的提取

將5種植物全株采集后清洗干凈，自然晾干，75℃溫度下于烘箱內(nèi)烘干12 h，粉碎.分別稱取5種植物干燥恒重樣品1 g于小錐形瓶中，加50%乙醇25mL，50℃水浴2 h，超聲20min，進(jìn)行抽濾，濾液收集，再在濾渣中加入50%乙醇25 mL，50℃水浴2 h，超聲20 min，進(jìn)行抽濾，濾液收集，將兩次濾液合并，棄濾渣，記錄所得濾液的體積，測(cè)定濾液，即樣液.

1.2.1.2 吸光度-蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

標(biāo)準(zhǔn)液的制備：準(zhǔn)確稱取120℃干燥恒重的蘆丁20 mg，用95%乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻得到濃度為2μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4 mL分別置于10mL容量瓶中，加水至5 mL，加5% NaNO20.3 mL搖勻，放置6 min，加5%Al（NO3）30.3 mL放置6 min，4%NaOH溶液4.4 mL，放置12 min.于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得A=0.0084，B=10.255，相關(guān)系數(shù)R=0.995.

1.2.1.3 總黃酮含量的測(cè)定

精確吸取樣液2mL于3支10 mL的試管中，加水至5 mL，再加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min.加5%Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，放置6min.加4%NaOH溶液4.4mL，放置12min，以試劑空白作對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度.查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到A、B值，而后計(jì)算出樣液中總黃酮的含量.

計(jì)算方法：總黃酮含量=總黃酮的濃度×10/2×（材料提出的溶劑量）/1000×100%，

總黃酮濃度=（OD值的平均值-A）/B.

1.2.2 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 鐵還原力的測(cè)定

取不同濃度5種植物的總黃酮提取液1 mL，與pH=6緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀2.5 mL混合后于50℃恒溫水浴鍋中水浴20 min，再加2.5 mL TCA溶液，于300 r/min離心機(jī)中離心10 min，分A1、A2兩組，A1取上清液2.5 mL，加2.5 mL單蒸水和0.5 mL FeCl3，A2取上清液2.5 mL，加3 mL單蒸水，將A1、A2在700 nm下測(cè)吸光值.

還原能力=A1-A2.

1.2.2.2 DPPH（二苯基苦基苯肼）自由基清除活性的測(cè)定

分別取5、10、15、20、30、40μL總黃酮提取液加蒸餾水配成1 mL，設(shè)置對(duì)照組為只加1 mL蒸餾水，然后加入1 mL DPPH溶液，室溫下保溫30 min，在517 nm下測(cè)吸光值.

DPPH自由基清除活性（%）=［（A0-A1）/A0×100］，

A0是對(duì)照樣品的吸光值，A1是樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值.

1.2.2.3 ABTS+（2，2-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）清除活性的測(cè)定

ABTS自由基溶液的制備：0.0132 g過(guò)硫酸鉀加入20 mL含0.0768 g ABTS+的水溶液中，置于暗處16 h形成穩(wěn)定的藍(lán)色溶液.測(cè)定時(shí)，取2 mL該溶液加入約150 mL雙蒸水中，使溶液于734 nm測(cè)得吸光值為0.700（±0.010）.將5種植物總黃酮提取液稀釋20倍后，分別取30、50、70、90、110、130μL與蒸餾水配成150μL不同濃度稀釋液加入3 mL ABTS溶液中，迅速測(cè)定吸光值，6 min后再次測(cè)定.

ABTS自由基清除活性（%）=［（A0-A1）/A0×100］，

A0是對(duì)照樣品的吸光值，A1是樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值.

1.3 數(shù)據(jù)采集及分析

上述實(shí)驗(yàn)每種植物做3次重復(fù)，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的平均值.用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 5種鱗毛蕨科植物的總黃酮含量

5種鱗毛蕨科植物中都含有黃酮類化合物，總黃酮含量在5%～8%之間；種間總黃酮的含量存在差異，其中含量較高的是狹頂鱗毛蕨（8.24%）和半島鱗毛蕨（6.53%），其次是戟葉耳蕨（5.2%），含量較低的是變異鱗毛蕨（5.01%）和暗鱗鱗毛蕨（5.01%）.

2.2 5種鱗毛蕨科植物鐵還原力分析

鐵還原力測(cè)定原理為Fe3+可被樣品中還原物質(zhì)還原為Fe2+形式，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并于700 nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光值的大小計(jì)算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱［13］.從圖1可以看出，所測(cè)5種鱗毛蕨科植物都存在一定的鐵還原力，鐵還原力達(dá)到25%時(shí)所需提取液的量各有差異.狹頂鱗毛蕨還原力達(dá)到25%時(shí)所需稀釋20倍的提取液用量最少，為38μL；暗鱗鱗毛蕨還原力達(dá)到25%時(shí)所需稀釋20倍的提取液用量最多，為81μL.在一定范圍內(nèi)，隨5種鱗毛蕨科植物總黃酮濃度的增加，鐵還原力逐漸增大.

2.3 5種鱗毛蕨科植物DPPH自由基清除活性

在DPPH自由基清除法中，DPPH可在有機(jī)溶劑中形成一種穩(wěn)定的自由基，呈紫紅色，且具有典型的特征吸收峰；當(dāng)反應(yīng)體系中存在抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑提供氫原子和電子給DPPH自由基，使其生成無(wú)色產(chǎn)物，使溶液吸光值變?。?4］.從圖2可知，所測(cè)5種鱗毛蕨科植物都存在一定的DPPH清除能力.其中，半島鱗毛蕨DPPH自由基清除活性達(dá)到50%時(shí)所需的提取液最少，為6μL，戟葉耳蕨DPPH自由基清除活性達(dá)到50%時(shí)所需的提取液最多，為19μL.在DPPH體系中，5種鱗毛蕨科植物總黃酮提取液中清除DPPH自由基的能力大小比較依次為，狹頂鱗毛蕨＞暗鱗鱗毛蕨＞變異鱗毛蕨＞戟葉耳蕨＞半島鱗毛蕨，可見(jiàn)，它們清除DPPH自由基能力隨總黃酮濃度的增加而增大.5種植物具有較好的抗氧化活性，在較低的濃度下自由基清除活性即可達(dá)50%以上，說(shuō)明5種植物中所含黃酮是氫離子的良好供體，在體系中能生成穩(wěn)定的DPPH-H化合物.

圖1 5種鱗毛蕨科植物的鐵還原力比較

圖2 5種鱗毛蕨科植物對(duì)DPPH的清除能力比較

2.4 5種鱗毛蕨科植物ABTS自由基清除活性

在ABTS自由基清除體系中，ABTS+經(jīng)氧化后生成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS水溶性自由基，抗氧化劑與ABTS+自由基反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光值降低.溶液褪色越明顯則表明所檢測(cè)物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)［14］.從圖3看，所測(cè)5種鱗毛蕨科植物都存在一定的ABTS+清除活性.在ABTS+體系中，暗鱗鱗毛蕨ABTS+清除活性達(dá)到50%時(shí)所需的提取液最少，為98μL，戟葉耳蕨ABTS+清除活性達(dá)到50%時(shí)所需的提取液最多，在140μL以上.5種鱗毛蕨科植物總黃酮提取液中清除DPPH自由基的能力分別為暗鱗鱗毛蕨＞狹頂鱗毛蕨＞變異鱗毛蕨＞半島鱗毛蕨＞戟葉耳蕨，且它們清除ABTS自由基能力隨總黃酮濃度的增加而增大.

圖3 5種鱗毛蕨科植物對(duì)ABTS自由基的清除活性比較

3 討 論

黃酮類化合物廣泛存在于鱗毛蕨科植物中，且在種間存在顯著差異.已知文獻(xiàn)中黃酮含量較高的是有蓋肉刺蕨（5.88%），較少的為刺頭復(fù)葉耳蕨（1.199%）［9-10］.本研究中狹頂鱗毛蕨和半島鱗毛蕨的黃酮含量較有蓋肉刺蕨高，其他3種植物也都在5%以上.可見(jiàn)，這5種植物是鱗毛蕨科中富含黃酮類化合物的良好資源.

根據(jù)本研究結(jié)果可知，總黃酮含量較高的狹頂鱗毛蕨和半島鱗毛蕨的鐵還原力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力都較高；總黃酮含量較低的戟葉耳蕨和變異鱗毛蕨的鐵還原力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均較低.可見(jiàn)，黃酮類化合物的添加量在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)與其抗氧化活性呈正相關(guān)，與曹建國(guó)等［15-17］、張敏等［18］、劉冬梅等［19］和唐津忠等［20］的研究結(jié)果相一致.

在本研究中，總黃酮含量較低的暗鱗鱗毛蕨的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力較高，分析可能是與黃酮提取液中的具體成分存在差異有關(guān)［6］.

黃酮類化合物在蕨類植物根、莖和葉中的含量尚有很大差異［18］.因此，可在后續(xù)的研究中分別提取5種植物根、莖和葉的總黃酮，并對(duì)其具體有效成分進(jìn)行分離，為鱗毛蕨科黃酮類化合物的利用積累資料.

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Study on content and antioxidation activity of total flavonoids from five species of Dryopteridaceae plants

HUANG Su′nan，WANG Xin，CAO Jianguo，DAIXiling
（College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai200234，China）

The content and antioxidation activity of total flavonoids extracted from 5 species of Dryopteridaceae plants were studied by aluminum color spectrophotometry.The results showed that the 5 species of Dryopteridaceae plants contained flavonoids，which content ranged from 5%to 8%.Dryopteris lacera appeared the highest total flavonoid content（8.24%）；D.atrata and D. uaria appeared the lowest（5.01%）.The total flavonoids content of Polystichum tripteron（5.2%）and D.peninsulae（6.53%）are in themiddle.The flavonoids extracted from the 5 species of Dryopteridaceae plants show a good antioxidant activity，and the content of flavonoids extracted from the plantswas in direct proportion to the antioxidation（Iron reducing power，DPPH free radical scavenging activity，ABTS+scavenging activity）.This paper is to provide a reference to the development and utilization of Dryopteridaceae plants.

Dryopteridaceae；total flavonoid；antioxidant activity

R 284

A

1000-5137（2015）05-0490-05

（責(zé)任編輯：顧浩然）

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.05.006

2014-11-15

上海市自然科學(xué)基金（15ZR1430500）

戴錫玲，中國(guó)上海市徐匯區(qū)桂林路100號(hào)，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，郵編：200234，E-mail：daixiling2010@shnu.edu.cn