◎王華芳

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院，河南三門峽472000）

超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮工藝研究

◎王華芳

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院，河南三門峽472000）

以杜仲葉為原料，研究了超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的工藝條件，并以總黃酮提取率為指標(biāo)，通過(guò)設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)研究了萃取溫度、壓強(qiáng)和時(shí)間對(duì)超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的影響。結(jié)果表明：三因素對(duì)提取率的影響順序?yàn)閴簭?qiáng)＞溫度＞時(shí)間，最佳提取工藝條件為溫度50℃，壓強(qiáng)30MPa，時(shí)間120min。同時(shí)按照最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證提取，提取率高達(dá)10.55%。

超臨界CO2；萃取；杜仲葉；總黃酮

杜仲是一種名貴的中藥材，蘊(yùn)含有豐富的天然活性物質(zhì)，如木脂素類、多糖、有機(jī)酸、黃酮類化合物等，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎，降壓等作用[1]。杜仲葉同杜仲皮成分基本一致，含有豐富的黃酮類化合物，該類物質(zhì)是杜仲藥效的主要活性成分之一，具有擴(kuò)張冠狀血管、促進(jìn)血液循環(huán)、抗炎、抗病毒、抗癌、保肝利水、美容美發(fā)及祛斑等功效[2-5]，目前已經(jīng)應(yīng)用于功能性保健品的研發(fā)中。

河南省靈寶市是中國(guó)現(xiàn)存的杜仲的唯一原產(chǎn)地，杜仲資源相當(dāng)豐富，占全世界杜仲產(chǎn)量的99.9%以上。目前三門峽市從事關(guān)于杜仲深加工開(kāi)發(fā)利用的企業(yè)頗多，其研制開(kāi)發(fā)的杜仲系列保健產(chǎn)品具有市場(chǎng)銷路好、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)。但是，在前期調(diào)研中我們發(fā)現(xiàn)，這些企業(yè)科研技術(shù)上還存在杜仲資源利用率偏低、后期處理難度大等問(wèn)題，因此本著服務(wù)地方企業(yè)科研需求的理念，我們嘗試尋求一種更高效、環(huán)保的技術(shù)來(lái)提高杜仲葉總黃酮萃取率。

目前關(guān)于杜仲有效物質(zhì)的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法、微波提取法和超聲波輔助萃取[6-10]等。超臨界CO2流體萃取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型萃取技術(shù)，具有提取率高、中藥有效成分不被破壞、操作溫度低，無(wú)有機(jī)溶劑殘留、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用在中草藥有機(jī)成分萃取研究中，如李作梅[11]等研究了其在竹葉中總黃酮的萃取技術(shù)。

筆者利用超臨界CO2萃取技術(shù)開(kāi)展杜仲葉次生代謝物總黃酮提取研究,在實(shí)驗(yàn)中，我們以總黃酮含量為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化杜仲葉中總黃酮提取工藝，確定了最佳工藝條件，為杜仲藥用資源的開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)際參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

杜仲葉采于河南省靈寶市，洗凈、烘干、粉碎過(guò)40目篩后備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品鑒定所；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純；

1.2 主要儀器

FA604A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；超臨界CO2萃取儀HA120-50-01型超臨界萃取裝置；中興高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海滬升實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 杜仲葉總黃酮的萃取

準(zhǔn)確稱取粉碎后的杜仲葉原料10g放入萃取釜，將20mL無(wú)水乙醇夾帶劑泵入萃取釜中，設(shè)定溫度、壓力和萃取時(shí)間，通入CO2進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后收集提取液，測(cè)定其總黃酮濃度。

以總黃酮含量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響，同時(shí)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)三因素三水平9次正交實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證超臨界CO2流體萃取總黃酮的最佳工藝條件。

1.3.2 杜仲葉總黃酮含量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法[12]測(cè)定總黃酮的含量，并計(jì)算其含量。

1.3.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取20mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，以無(wú)水乙醇溶液定容于25mL容量瓶中,作為對(duì)照溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1，2，3,4,5mL置于10mL容量瓶中，分別加入1mL5%的NaNO2溶液，1mL10%硝酸鋁溶液，4mL%NaOH溶液，以上三種溶液每一樣加入之后均搖勻靜置5min，最后用無(wú)水乙醇溶液定容至刻度線，混勻放置15min后，備用。對(duì)標(biāo)液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，找出最大吸收波長(zhǎng)。以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 杜仲葉總黃酮含量計(jì)算

測(cè)量提取液吸光度值A(chǔ)，將其代入線性回歸方程，計(jì)算出總黃酮的濃度?？傸S酮物質(zhì)的含量按下式計(jì)算：

其中Y為黃酮提取率，C為提取液中黃酮濃度mg/mL，V為提取液體積mL,W為原料重量mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)量波長(zhǎng)選擇

以無(wú)水乙醇溶液為參比，對(duì)提取液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，如圖1所示，吸光度值在波長(zhǎng)505nm處有強(qiáng)烈吸收，且峰形平緩，符合最大吸收波長(zhǎng)選擇的條件，因此選擇505nm為測(cè)量波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以無(wú)水乙醇溶液參比，按照1.3.2.1方法配制系列不同濃度的蘆丁溶液，并測(cè)量其吸光度值，同時(shí)以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)下圖2，擬合線性回歸方程為：A= 0.6841?C+0.1881，R2=0.9939，線性關(guān)系良好。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 萃取溫度對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10g杜仲葉粉末5份，分別加入20mL無(wú)水乙醇夾帶劑，設(shè)定壓力30MPa,萃取時(shí)間90min，分別考察溫度在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的萃取率。

由圖3可知，當(dāng)壓強(qiáng)和萃取時(shí)間固定后，隨著溫度的升高，提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并且在55℃下達(dá)到最高值，這可能是隨著溫度的升高，黃酮溶解度增加，之后由于溫度過(guò)高，導(dǎo)致CO2流體密度降低所致，因此選擇55℃下萃取是比較合適的。

2.3.2 萃取壓力對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10g杜仲葉粉末5份，分別加入20mL無(wú)水乙醇夾帶劑，設(shè)定溫度55℃,萃取時(shí)間90min，分別考察壓力在20MPa、25MPa、30MPa、35MPa、40MPa的萃取率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

在20MPa～30MPa區(qū)間時(shí)，黃酮提取率隨著壓強(qiáng)的增大迅速上升，主要是由于壓力增大，CO2流體與溶質(zhì)之間的滲透增大，有利于萃取。當(dāng)壓強(qiáng)過(guò)高時(shí)，提取率增幅平緩，基本保持不變，這可能是由于高壓下CO2的可壓縮性小，進(jìn)而無(wú)法增大其溶解力所致。另外，從設(shè)備安全性角度考慮，壓強(qiáng)也不能太高。因此，壓強(qiáng)取30MPa比較合適。

2.3.3 萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取10g杜仲葉粉末5份，分別加入20mL無(wú)水乙醇夾帶劑，設(shè)定溫度55℃,壓力MPa，分別考察萃取時(shí)間在30min、60min、90min、120min、150min下的萃取率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖五可知，萃取時(shí)間對(duì)提取率影響顯著，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)提取率顯著上升，這主要是增加了溶劑溶質(zhì)接觸的時(shí)間，有利于萃取完全。但是當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)一個(gè)小時(shí)后增幅減緩，可能是由于剩余杜仲葉中總黃酮較少，雜質(zhì)較多，導(dǎo)致提取率減少，因此，從提高效率和節(jié)約資源的角度，選擇90min比較合適。

圖1 蘆丁全波長(zhǎng)掃描曲線

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線八繪制

圖3 溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖4 萃取壓力對(duì)黃酮提取率的影響

圖5 萃取壓力對(duì)黃酮提取率的影響

2.4 正交及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為指標(biāo)，選擇萃取溫度、壓強(qiáng)和時(shí)間三因素進(jìn)行三水平9次試驗(yàn)，找到最佳提取工藝條件,正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，直觀分析表見(jiàn)表2。

由直觀分析表可知，三因素對(duì)提取率的影響順序?yàn)锽＞A＞C，即壓強(qiáng)對(duì)提取率影響最大，其次是溫度，最后是時(shí)間，最佳提取工藝條件為A1B2C3，即萃取溫度50℃，萃取壓強(qiáng)30MPa,萃取時(shí)間120min。與單因素實(shí)驗(yàn)相比較，壓強(qiáng)取值同單因素實(shí)驗(yàn)一致，溫度由單因素實(shí)驗(yàn)中的55℃降低到了50℃，而萃取時(shí)間則有90min延長(zhǎng)到了120min,也就是說(shuō)通過(guò)延長(zhǎng)時(shí)間來(lái)彌補(bǔ)溫度降低所造成的提取率下降，這樣在保證提取率的前提下，不僅可以降低溫度過(guò)高對(duì)設(shè)備的損耗，還可以降低成本，完全有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

按照正交優(yōu)化最佳實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮提取率為10.55%，是所有試驗(yàn)中提取率最高的，進(jìn)一步驗(yàn)證了正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的可靠性。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9（33）正交試驗(yàn)直觀分析表

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)可知，超臨界CO2萃取技術(shù)能夠很好地完成杜仲葉中總黃酮的提取，在萃取溫度50℃，萃取壓強(qiáng)30MPa,萃取時(shí)間120min的條件下，萃取效率最高。另外，由于超臨界CO2萃取過(guò)程主要靠流體與原料的充分接觸完成萃取，因此具有雜質(zhì)少，無(wú)污染，后期處理方便等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，通過(guò)簡(jiǎn)單比較可知，其操作過(guò)程較傳統(tǒng)有機(jī)提取方法簡(jiǎn)單的多，因此，超臨界CO2萃取技術(shù)可以作為替代傳統(tǒng)有機(jī)萃取方法應(yīng)用于杜仲葉總黃酮的工藝提取中。

[1]程光麗.杜仲有效成分分析及藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中成藥，2006（5）：723-725.

[2]楊芳，岳正剛，王欣，等.杜仲葉化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014,39（8）：1445-1449.

[3]李建民.杜仲抗氧化生物活性研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010,3（8）：138.

[4]孟良玉，蘭桃芳，盧佳琨，等.敗醬草中黃酮類化合物提取及其抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2010,31（24）：214-217.

[5]周程艷,馬紅翠,王美,等.不同采收期杜仲葉和果實(shí)總黃酮和多糖含量比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17 (11):111-114.

[6]楊玉瓊,王偉,陶忠遠(yuǎn),等.丙酮一乙醇一水三組分體系提取杜仲葉中總黃酮[J].微量元素與健康研究，2010，27（5）：43-45.

[7]鄭有飛,石春紅,汪本有，等.天然黃酮物質(zhì)提取技術(shù)和分析方法的研究進(jìn)展[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2009,25（14）：102-107.

[8]劉桂萍，焦飛飛.超聲波輔助提取杜仲葉總黃酮[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（11）：258-261.

[9]徐麗萍，喻方圓，陳浩，等.超聲波提取杜仲皮總黃酮工藝[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā),2010,4(14):82-84.

[10]彭艷.杜仲總黃酮的提取工藝優(yōu)化[J].中國(guó)藥業(yè)，2011,20(12):41-42.

[11]李作美，王永斌，高世霞，等.超臨界CO2萃取竹葉中總黃酮的研究[J].中國(guó)釀造，2009（6）：102-104.

[12]劉俊海，任慧蘭，裘愛(ài)泳，等.杜仲葉總黃酮提取工藝研究[J].食品與機(jī)械，2007,23(4):92-95.

（責(zé)任編輯 卞建寧）

Extraction of total Flavonoids from Eucommia Ulmoid leaves by Supercritical Fluids CO2

WANG Hua-fang
(College of Food Garden,Sanmenxia Polytechnic，Sanmenxia 472000,China)

Studied the extraction technological conditions of the supercritical fluids CO2in Eucommia ulmoide leaves.Then with the the extraction rate of total flavonoids as the index,through the design of L9(33)orthogonal test to research the effects of three factors for the extraction rate.The result showed that the effect order is the press highest,then is temperature,and the time is lowest.And the optimum extraction conditions as follows the press 30MPa,the temperature 50℃and the time 120min.In the optimum extraction conditions,the extraction rate is 10.55%.

Supercritical CO2;Extraction;Leaves of eucommia ulmoides;Total flavonoids

TS201.1

A

1671-9123（2015）02-0132-05

2015-01-29

王華芳（1982-），女，河北邯鄲人，三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院講師。