陳瓊，張瑾，李小猛，劉磊

安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院 安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601

幾種抗生素對(duì)蛋白核小球藻的時(shí)間毒性微板分析法

陳瓊，張瑾*，李小猛，劉磊

安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院 安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601

抗生素在不同的暴露時(shí)間可能具有不同的毒性變化規(guī)律。本文以蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)為受試生物，96孔微板為暴露實(shí)驗(yàn)載體，5種抗生素硫酸安普霉素、氯霉素、雙氫鏈霉素、硫酸新霉素和硫酸鏈霉素為研究對(duì)象，通過(guò)在C. pyrenoidosa生長(zhǎng)周期內(nèi)選取6個(gè)暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)(即0、12、24、48、72和96 h)，建立了抗生素在不同暴露時(shí)間對(duì)C. pyrenoidosa生長(zhǎng)抑制毒性的微板測(cè)試方法(簡(jiǎn)稱T-MTA)，并應(yīng)用T-MTA方法系統(tǒng)測(cè)定了5種抗生素對(duì)C. pyrenoidosa在不同暴露時(shí)間的生長(zhǎng)抑制毒性。結(jié)果表明，抗生素對(duì)C. pyrenoidosa生長(zhǎng)抑制毒性具有明顯的時(shí)間依賴特征，即在開始的時(shí)候基本無(wú)毒性，而后毒性迅速增加，然后毒性增加速度減慢；不同抗生素的毒性隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)增加速率不同；同一暴露時(shí)間內(nèi)，5種抗生素對(duì)C. pyrenoidosa的毒性大小不同；且毒性順序隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生變化。

抗生素；蛋白核小球藻；時(shí)間依賴毒性；微板毒性分析

越來(lái)越多的研究表明，環(huán)境污染物的毒性不僅與暴露的劑量有關(guān)，暴露時(shí)間也是一個(gè)重要的因素[1]。如Zhu等[2]采用濃度-時(shí)間-效應(yīng)曲面(CTES)研究發(fā)現(xiàn)6種三嗪類除草劑對(duì)發(fā)光菌Q67的毒性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，但不同的毒物，其毒性增加的幅度不同。Hatano等[3]研究發(fā)現(xiàn)重金屬對(duì)3種水生生物：三葉浮萍、虹鱒魚和大型蚤的毒性均具有很強(qiáng)的時(shí)間依賴性。還有的作者發(fā)現(xiàn)部分污染物在不同暴露時(shí)間的濃度-效應(yīng)曲線還具有不同的形狀如離子液體對(duì)發(fā)光菌Q67的毒性效應(yīng)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由抑制發(fā)光效應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榇碳ぐl(fā)光效應(yīng)[4-5]。這些研究表明，不同類型和不同結(jié)構(gòu)的污染物可能具有不同的時(shí)間毒性規(guī)律和作用機(jī)制。因此，污染物毒性的檢測(cè)不僅要關(guān)注其在某一特定時(shí)間對(duì)暴露生物的效應(yīng)，更應(yīng)該著眼于其對(duì)暴露生物隨著時(shí)間而變化的動(dòng)態(tài)效應(yīng)[6]。這不僅有助于全面了解污染物的毒性效應(yīng)，而且能更深入地了解污染物的毒理作用機(jī)制與途徑。

綠藻作為生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者和水生食物鏈的基本環(huán)節(jié)，對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著重要作用。因其個(gè)體小、繁殖快、對(duì)毒物敏感、易于分離培養(yǎng)以及可直接觀察細(xì)胞水平上的中毒癥狀，常被用于測(cè)定污染物的毒性。藻毒性測(cè)試已成為一種廣泛應(yīng)用的生物監(jiān)測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)方法，如國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)[7]、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)[8]、美國(guó)環(huán)保署(USEPA)[9]以及中國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局均將藻類生長(zhǎng)抑制毒性試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)毒性測(cè)試方法[10]。蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)屬于綠藻門，小球藻屬，是游離單細(xì)胞藻，直徑3～5 μm，球形或橢圓形，繁殖快，可以在較短時(shí)間內(nèi)考察污染物對(duì)藻類世代和種群水平上的影響，便于培養(yǎng)和試驗(yàn)。此外，藻液分布均勻不易沉降，其與污染物的接觸更充分。目前，C. pyrenoidosa已成為囯內(nèi)外常用的污染物毒性測(cè)試的受試生物之一，如利用C. pyrenoidosa測(cè)定金屬納米顆粒物的毒性作用[11]，研究十六烷基溴化銨等表面活性劑、商品氯氰菊酯農(nóng)藥以及藥物等對(duì)C. pyrenoidosa的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)[12-14]，測(cè)試水中砷鉻鉛鎘汞的急性毒性[15]。

然而，目前的藻毒性測(cè)試方法多采用三角玻璃瓶法，該方法的缺點(diǎn)：測(cè)試儀器不能同時(shí)測(cè)定大量平行樣品，而且試液用量大，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力而且浪費(fèi)試劑。因此，袁靜等[16]建立了以酶標(biāo)儀為檢測(cè)儀器和96孔板為載體的藻毒性微板分析法，暴露時(shí)間為96 h。利用這一測(cè)試體系，研究了多個(gè)化合物及其混合物的毒性，包括重金屬、農(nóng)藥和離子液體等化合物，獲得了大量化合物的完整濃度-效應(yīng)毒性信息。結(jié)果表明，藻微板毒性分析測(cè)試法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、節(jié)省試劑及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。不幸的是，上述這些藻毒性測(cè)試方法只獲得某一暴露時(shí)間終點(diǎn)如72 h或96 h的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50值，仍不能獲得不同時(shí)間的污染物毒性效應(yīng)變化規(guī)律。

醫(yī)藥品與個(gè)人護(hù)理品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)由于對(duì)環(huán)境的持續(xù)污染和有害性已成為繼POPs之后的又一類新型污染物[17]。抗生素由于使用量大、環(huán)境分布廣泛、潛在危害大，是目前PPCPs中最為關(guān)注的一類物質(zhì)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，抗生素可改變環(huán)境中微生物種類，破壞生態(tài)系統(tǒng)的平衡[19]；環(huán)境中抗生素殘留的持續(xù)存在，將誘導(dǎo)出抗藥菌株，通過(guò)食物等途徑進(jìn)入人體，對(duì)人類健康產(chǎn)生危害[20]。如Isidori等[21]研究了6種抗生素對(duì)非靶生物(水生生物)的急性、慢性和遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)急性毒性在mg·L-1水平，慢性毒性在μg·L-1水平，氯四環(huán)素具有遺傳毒性。劉臻等[22]研究發(fā)現(xiàn)氯霉素、紅霉素和四環(huán)素能引起熱帶爪蟾圍心腔水腫、泄殖腔增大或拉長(zhǎng)、肛門擴(kuò)張和尾部彎曲等多種畸形現(xiàn)象。因此，研究抗生素類藥物生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及其污染控制具有重要意義。

綜上所述，本文擬以C. pyrenoidosa為受試生物，以5種抗生素硫酸安普霉素(apramycin sulfate, APR)、氯霉素(chloramphenicol, CHL)、雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin sesquisulfate, DIH)、硫酸新霉素(neomycin sulfate, NEO)和硫酸鏈霉素(strepomycin sulfate, STS)為研究對(duì)象，建立基于C. pyrenoidosa的抗生素時(shí)間毒性微板分析法(time-dependent microplate toxicity analysis, T-MTA)，并應(yīng)用T-MTA系統(tǒng)測(cè)試5種抗生素對(duì)C. pyrenoidos的時(shí)間毒性。這不僅提供了上述5種抗生素在不同暴露時(shí)間的毒性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)還為研究其他具有時(shí)間依賴毒性特征的污染物提供檢測(cè)方法與數(shù)據(jù)分析手段。

表1 5種抗生素的基本性質(zhì)Table 1 Physical properties of five antibiotics

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

試劑：5種抗生素硫酸安普霉素(APR)、氯霉素(CHL)、雙氫鏈霉素(DIH)、硫酸新霉素(NEO)和硫酸鏈霉素(STS)均購(gòu)自上海原葉生物科技有限公司，其基本理化性質(zhì)見表1。采用milli-Q水配制抗生素儲(chǔ)備液，保存在棕色瓶中，置于4 ℃冰箱，備用。

主要儀器：BioRad酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、MGC-250型智能型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、BT25S型五位電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、70SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)和Dragon-lab單道可調(diào)移液器(10～100 μL)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 藻種與培養(yǎng)

蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)(FACHB)，編號(hào)為FACHB-5。

SE培養(yǎng)基配方：0.25 g NaNO3、0.075 g K2HPO4·3H2O、0.075 g MgSO4·7H2O、0.025 g CaC12·2H2O、0.175 g KH2PO4、0.025 g NaC1、0.05 mL FeC1·6H2O、1 mL EDTA-Fe、40 mL土壤浸出液和1 mL A5溶液。

EDTA-Fe：1 g Na2EDTA、81 mg FeC13·6H2O、50 mL 0.1 mol·L-1HC1和50 mL H2O。

A5溶液：286 mg H3BO3、181 mg MnC12·4H2O、22 mg ZnSO4·7H2O、7.9 mg CuSO4·5H2O、3.9 mg (NH4)6·Mo7O24·4H2O和100 mL H2O。

收到藻種后，稍松試管管蓋，放入恒溫光照振蕩培養(yǎng)箱，于(25±1) ℃、照度5 000 lx、光暗比l4 h∶10 h條件下培養(yǎng)。每隔10～15 d按1∶2稀釋轉(zhuǎn)接藻種擴(kuò)大培養(yǎng)，使之進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。接種時(shí)間應(yīng)在白天，藻類細(xì)胞代謝最旺盛時(shí)期(因傍晚至夜間藻類有細(xì)胞下沉現(xiàn)象)。整個(gè)過(guò)程要求絕對(duì)無(wú)菌操作。暴露試驗(yàn)前1～2 d轉(zhuǎn)接處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)至690 nm波長(zhǎng)下光密度(OD690)為0.2～0.3之間，備用。暴露試驗(yàn)中為避免揮發(fā)造成的誤差，微板加上透明蓋[16]。

1.3 微板設(shè)計(jì)與時(shí)間毒性測(cè)試

96孔透明微板中空白與污染物濃度梯度設(shè)計(jì)如圖1所示。在96孔微板的4周共36個(gè)孔中均加入200 μL的蒸餾水防止產(chǎn)生邊緣效應(yīng)；第6，7列共12個(gè)孔(b)中分別加入100 μL milli-Q水作為空白對(duì)照；第2列6個(gè)孔(ci, i=1, 2, 3, 4, 5, 6)以及第4列共6個(gè)孔(ci, i=7, 8, 9, 10, 11, 12)分別加入按稀釋因子設(shè)計(jì)的不同濃度污染物的溶液100 μL；第3和5列分別為第2列和第4列的平行試驗(yàn)；第8、9、10、11列為第2、3、4、5列的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。最后在空白和處理孔共60個(gè)孔中分別加入密度均勻、吸光度OD690值為0.20～0.30的100 μL藻液，使各孔總體積為200 μL；加透明蓋后置于溫度為(25 ± 1) ℃、光照強(qiáng)度為5 000 lx、光暗比14 h:10 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)為0，12 h，24 h，48 h，72 h和96 h時(shí)將微板取出，并放入酶標(biāo)儀中測(cè)定OD690。上述微板實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3板。

以污染物對(duì)C. pyrenoidosa的生長(zhǎng)速率μ的抑制率(E)為毒性效應(yīng)，計(jì)算不同暴露時(shí)間終點(diǎn)污染物的毒性：

Ei , j=(1-μi , j/μ0 , j)×100%

(1)

μj=(OD690, n-OD690, n-1)/OD690, n

(2)

式中，Ei, j為污染物濃度ci(i=1, 2, 3 ,…, 12)在暴露時(shí)間j(j=0, 12, 24, 48, 72, 96 h)對(duì)C. pyrenoidosa的生長(zhǎng)速率抑制率；μi,j為微板中污染物濃度ci處理孔中C. pyrenoidosa在暴露時(shí)間j時(shí)的平均生長(zhǎng)速率；μ0, j為微板空白孔中C. pyrenoidosa在暴露時(shí)間j(j=0 , 12, 24, 48, 72, 96 h)的平均生長(zhǎng)速率；μj為微板孔中C. pyrenoidosa在某一暴露時(shí)間j(j= 0, 12, 24, 48, 72, 96 h)的平均生長(zhǎng)速率；OD690,n為微板孔中C. pyrenoidosa在第n個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)(n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6)的平均吸光光度值；OD690,n-1為微板孔中C. pyrenoidosa在第n-1個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)的平均吸光光度值。

圖1 時(shí)間毒性微板分析法中微板設(shè)計(jì)示意圖注：b，空白；ci，第i個(gè)濃度。Fig. 1 Schematic diagram of the microplate design in a time-dependent toxicity microplate analysis where b refers to blank and ci to the concentration of the ith treatment

1.4 時(shí)間毒性數(shù)據(jù)處理

為了揭示不同暴露時(shí)間、不同濃度污染物對(duì)C. pyrenoidosa生長(zhǎng)抑制毒性變化規(guī)律，需要對(duì)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的濃度—效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合。對(duì)于濃度—效應(yīng)曲線(concentration-response curve, CRC)的濃度—效應(yīng)數(shù)據(jù)，采用兩參數(shù)非線性函數(shù)Weibull和Logit進(jìn)行擬合，選擇擬合值與試驗(yàn)觀測(cè)值之間的相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient, R)與均方根誤差(root mean square error, RMSE)評(píng)價(jià)CRC模型的擬合優(yōu)度，R值越大、RMSE越小，擬合越好[23]。2個(gè)用于描述實(shí)驗(yàn)毒性數(shù)據(jù)的非線性函數(shù)Weibull和Logit如式(3)和(4)所示：

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(3)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(4)

式中α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數(shù)，E為效應(yīng)即污染物對(duì)綠藻C. pyrenoidosa的生長(zhǎng)抑制率；c是污染物的濃度。

2 結(jié)果(Results)

2.1 同步生長(zhǎng)速率曲線和測(cè)定波長(zhǎng)選擇

為了檢測(cè)時(shí)間依賴毒性測(cè)試過(guò)程中C. pyrenoidosa是否處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，我們?cè)谒袑?shí)驗(yàn)中，均單獨(dú)設(shè)置一塊96孔板同步測(cè)試C. pyrenoidosa在微孔中的生長(zhǎng)曲線，其微板設(shè)計(jì)與時(shí)間依賴毒性測(cè)試類似：微板周邊的36個(gè)微孔加入200 μL蒸餾水，在剩余60個(gè)孔中均加入體積100 μL的蒸餾水，再加入100 μL已培養(yǎng)好的藻液，使試液總體積達(dá)到200 μL。結(jié)果見圖2(A)，綠藻C. pyrenoidosa在微板中經(jīng)短暫適應(yīng)期后開始快速增長(zhǎng)，36 h后C. pyrenoidosa生長(zhǎng)速率快速增加，72 h后開始下降，96 h后幾乎下降到初始生長(zhǎng)速率，120 h后幾乎不再生長(zhǎng)。因此，時(shí)間依賴毒性實(shí)驗(yàn)的測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)度最長(zhǎng)設(shè)置在96 h。

用1 cm比色皿、在波長(zhǎng)350～850 nm范圍內(nèi)、按步長(zhǎng)1 nm測(cè)定C. pyrenoidosa的紫外一可見吸收光譜圖譜，結(jié)果見圖2(B)。由圖2(B)可見，在波長(zhǎng)為446、504和690 nm處存在吸收峰，其中690 nm吸收峰最尖，光譜干擾較少，因此，綠藻C. pyrenoidosa的光密度OD值的測(cè)定選擇690 nm波長(zhǎng)處的吸收峰。

圖2 C. pyrenoidosa的生長(zhǎng)特性Fig. 2 Growth characteristic of Chlorella pyrenoidosa

2.2 濃度-效應(yīng)曲線CRC

由時(shí)間毒性微板分析法測(cè)得的5種抗生素在不同暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)(點(diǎn))以及通過(guò)非線性最小二乘擬合方法得到的統(tǒng)計(jì)量與回歸系數(shù)(位置參數(shù)α和斜率參數(shù)β)結(jié)果見表2，并將擬合所得的CRC曲線繪于圖3。

從表2可看出，Logit函數(shù)對(duì)暴露時(shí)間在48～96 h的毒性數(shù)據(jù)擬合的結(jié)果較好(R>0.91, RMSE<0.1)，但對(duì)暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)為24 h的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)擬合效果稍差，如CHL的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)的R值為0.6307，對(duì)0和12 h的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)不能有效擬合，可能因?yàn)樵诒┞稌r(shí)間24 h以內(nèi)，藻的生長(zhǎng)處于延遲期，數(shù)據(jù)不穩(wěn)定造成的，也可能是擬合函數(shù)不太合適。以半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的負(fù)對(duì)數(shù)pEC50為毒性指標(biāo)，5種抗生素的毒性均隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而在逐漸增強(qiáng)即具有典型的時(shí)間依賴特征。但不同抗生素在同一暴露時(shí)間的毒性不同，且毒性大小順序隨著時(shí)間延長(zhǎng)而變化，如在暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)24 h時(shí)，5種抗生素的毒性大小順序：CHL

表2 5種抗生素在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的擬合函數(shù)(Logit函數(shù)的α和β)、擬合統(tǒng)計(jì)量(R和RMSE)以及EC50和pEC50值Table 2 The regression parameters (α and β of Logit function), two statistics (R and RMSE), EC50 and pEC50 of five antibiotics at six time points

圖3 5種抗生素在6個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的濃度-效應(yīng)曲線Fig. 3 Concentration-response curves of five antibiotics at six time points

圖4 5種抗生素毒性隨時(shí)間的變化曲線Fig. 4 Plot of pECx versus time for five antibiotics

圖3也顯示5種抗生素均表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴毒性特征：在0～24 h，5種抗生素對(duì)C. pyrenoidosa基本無(wú)毒性，然后隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，毒性逐漸增加，在24～48 h內(nèi)毒性增加速度最快，此后毒性增加速度逐漸減慢。

3 討論(Discussion)

環(huán)境污染物的毒性不僅與暴露的劑量有關(guān)，暴露時(shí)間也是一個(gè)重要的因素。已有研究表明污染物對(duì)發(fā)光菌Q67的毒性具有時(shí)間依賴特征[24-26]。本文中5種抗生素對(duì)綠藻C. pyrenoidosa的毒性也具有明顯的時(shí)間依賴特征。為了進(jìn)一步說(shuō)明5種抗生素對(duì)C. pyrenoidosa的毒性具有明顯的時(shí)間依賴特征，我們將每種藥物的4個(gè)典型pECx值：pEC20、pEC30、pEC40和pEC50隨著時(shí)間變化趨勢(shì)繪成圖4。如圖4所示，5種抗生素的毒性值pEC20、pEC30、pEC40和pEC50均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但不同的抗生素增加規(guī)律不同。如APR、CHL和NEO的pEC20與pEC30值在0～12內(nèi)幾乎為0，在12～24 h內(nèi)毒性迅速增加，然后增加速度減慢，而pEC40和pEC50值在0～24 h內(nèi)幾乎為0，在24～48 h內(nèi)迅速增加，然后增加速度減慢。但是，CHL的4個(gè)毒性值pEC20、pEC30、pEC40和pEC50之間的差異較小。STS的pEC20值在0～12 h內(nèi)幾乎為0，在12～24 h內(nèi)迅速增加，然后增加速度減慢，而pEC30、pEC40和pEC50值在0～24 h內(nèi)幾乎為0，在24～48 h內(nèi)迅速增加，然后增加速度減慢。DIH的pEC20與pEC30值在0～24 h內(nèi)幾乎為0，在24～48 h內(nèi)迅速增加，然后增加速度減慢，而pEC40和pEC50值在0～48 h內(nèi)幾乎為0，在48～72 h內(nèi)迅速增加，然后增加速度減慢。這與林楠等所獲的研究結(jié)論類似[24]。

上述研究結(jié)果顯示，污染物的毒性大小及其變化規(guī)律也會(huì)隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)變化，這就要求我們?cè)谶M(jìn)行污染物生態(tài)毒性評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，同時(shí)考慮濃度與時(shí)間2個(gè)因素，才能全面了解污染物的毒性效應(yīng)，更深入的了解污染物的毒性作用機(jī)制與途徑，更能體現(xiàn)實(shí)際環(huán)境中污染物暴露的現(xiàn)象和信息，同時(shí)提高生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的可信性[6]。

本文建立了不同暴露時(shí)間下污染物對(duì)綠藻C. pyrenoidosa的生長(zhǎng)抑制毒性的微板測(cè)試分析方法，并成功地應(yīng)用于環(huán)境中普遍存在的5種抗生素APR、STS、DIH、NEO和CHL對(duì)C. pyrenoidosa的時(shí)間依賴毒性測(cè)試。5種抗生素對(duì)綠藻C. pyrenoidosa的毒性均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加：在開始的24 h內(nèi)基本無(wú)毒性，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，毒性迅速增加，而后毒性增加的速度逐漸減慢。5種抗生素對(duì)C. pyrenoidosa在同一暴露時(shí)間的毒性大小不同。且在不同的暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)，5種抗生素的毒性順序也不同。以半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的負(fù)對(duì)數(shù)pEC50為毒性指標(biāo)，在24 h暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)的毒性順序：CHL

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◆

Time-dependent Microplate Toxicity Analysis (T-MTA) of Several Antibiotics toChlorellapyrenoidosa

Chen Qiong, Zhang Jin*, Li Xiaomeng, Liu Lei

Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province, College of Environment and Energy Engineering, Anhui Jianzhu University, Hefei 230601, China

30 June 2014 accepted 14 August 2014

Antibiotics probably have different toxicity features in different exposure times. Selecting Chlorella pyrenoidosa (C. pyrenoidosa) as a test organism, 96-well microplate as exposure experiment carrier and five antibiotics, apramycin sulfate, chloramphenicol, dihydrostreptomycin sesquisulfate, neomycin sulfate and strepomycin sulfate, as test chemicals, a time-dependent microplate toxicity analysis (T-MTA) was developed. Using the T-MTA, the time-dependent toxicities of the five antibiotics on C. pyrenoidosa were determined at six exposure time points such as 0, 12, 24, 48, 72 and 96 h. The results showed that the toxicities of the antibiotics exhibited significant time-dependent features, i.e., they had almost no toxicities on C. pyrenoidosa at first, then their toxicities increased rapidly, and finally increased slowly. However, the antibiotics had different increasing rates for the time-dependent toxicities. The toxicities of five antibiotics were different at the same exposure time. Moreover, the orders of toxicity of the antibiotics at different exposure times were different.

antibiotics; Chlorella pyrenoidosa; time-dependent toxicity; microplate toxicity analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金(21207002)；博士科研啟動(dòng)基金；大學(xué)生科技創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)(201310878060；AH201310878107)

陳瓊(1988-)，男，碩士，研究方向?yàn)槲廴疚锘瘜W(xué)與毒理學(xué)，E-mail: 13093549315@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: ginnzy@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140630004

2014-06-30 錄用日期：2014-08-14

1673-5897(2015)2-190-08

X13

A

張瑾(1978—)，女，博士，副教授，近年主要從事有機(jī)污染物化學(xué)與毒理學(xué)研究，發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇。

陳瓊, 張瑾, 李小猛, 等. 幾種抗生素對(duì)蛋白核小球藻的時(shí)間毒性微板分析法[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 190-197

Chen Q, Zhang J, Li X M, et al. Time-dependent microplate toxicity analysis (T-MTA) of several antibiotics to Chlorella pyrenoidosa [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 190-197 (in Chinese)