劉汝洋 高國芬 杜志華

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000;2.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004)

鼻咽癌組織中iNOS的表達與微血管密度計數(shù)的研究

劉汝洋1高國芬2杜志華1

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000;2.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550004)

目的探討誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在鼻咽癌中的表達與鼻咽癌生物學(xué)行為的關(guān)系，探討腫瘤血管生成與鼻咽癌生物學(xué)行為的關(guān)系，探討iNOS的表達與鼻咽癌血管生成的關(guān)系。方法采用非生物素二步免疫組化法，檢測iNOS在鼻咽癌組織中表達，并根據(jù)CD34相關(guān)抗原標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果鼻咽癌組織中MVD顯著高于慢性鼻咽炎組織(27.7±8.88 vs 9±3.1，P＜0.05)。MVD與年齡、性別無關(guān)，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期組的MVD顯著高于Ⅰ、Ⅱ期組(30.7±4.7 vs 22.2±7.5，P＜0.05)。淋巴轉(zhuǎn)移組MVD顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組(29.6±4.8 vs 20.5±4.8，P＜0.05)。iNOS在鼻咽癌組織中陽性表達率為56.25%，iNOS的表達與年齡、性別無關(guān)。臨床分期Ⅲ、Ⅳ期組iNOS的陽性表達率為70.97%，顯著高于Ⅰ、Ⅱ期組29.41%(P＜0.05)。淋巴轉(zhuǎn)移組iNOS的陽性表達率為65.79%，顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組20.00%(P＜0.05)。iNOS陽性表達組的MVD顯著高于iNOS陰性表達組(30.0±5.4 vs 24.0±6.0，P＜0.05)。結(jié)論血管生成及iNOS的表達與鼻咽癌生物學(xué)行為關(guān)系密切。iNOS表達促進了鼻咽癌血管生成及頸淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。測定MVD及iNOS的表達有助于判斷鼻咽癌的惡性程度及預(yù)后。

鼻咽癌;血管生成，微血管密度;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;免疫組化

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方高發(fā)的上皮源性的惡性腫瘤，其發(fā)病率居我國頭頸部惡性腫瘤首位［1］。惡性腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移過程受多種因素的影響。近年來，越來越多的研究表明，實體腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移具有血管生長依賴性。新生血管不但為其生長提供營養(yǎng)、排泄代謝產(chǎn)物，而且為其轉(zhuǎn)移提供通道［2］。腫瘤誘導(dǎo)的血管生成與其生物學(xué)行為密切相關(guān)。本課題通過免疫組織化學(xué)的方法檢測鼻咽癌組織中iNOS的表達和微血管密度(MVD)，旨在探討iNOS在鼻咽癌組織中表達及其與MVD、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對進一步研究鼻咽癌的生物學(xué)特性，了解其機制可能有一定的理論價值和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2005年12月—2007年9月門診耳鼻喉科纖維鏡室鼻咽部鱗狀細胞癌活檢組織及貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科部分存檔鼻咽部鱗狀細胞癌活檢組織蠟塊48例，慢性鼻咽炎活檢標(biāo)本13例。48例鼻咽癌患者中，男32例，女16例，年齡18～71歲，平均46歲，全部病例活檢前均未經(jīng)放療和化療。按照鼻咽癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(92福州標(biāo)準(zhǔn))進行臨床分期:Ⅰ期6例，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期13例(其中Ⅰ期、Ⅱ期定為早期，Ⅲ期、Ⅳ期定為晚期)。根據(jù)頸部是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組:其中頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組38例，非轉(zhuǎn)移組10例。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色復(fù)查確診。

1.2 主要試劑兔抗人iNOS、兔抗人CD34購自武漢博士德生物工程有限公司，PV6001、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法采用非生物素二步免疫組化法，檢測iNOS在鼻咽癌組織中表達，并根據(jù)CD34相關(guān)抗原標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞。石蠟切片脫蠟和水化后，抗原熱修復(fù)，H2O2孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗(iNOS和CD34)，孵育，PBS沖洗，滴加PV6001，孵育，PBS沖洗，加DAB溶液，蘇木素復(fù)染;切片干燥、透明，樹膠封固。

以上實驗步驟均按試劑盒說明書進行;用已知陽性切片(乳腺癌切片)作陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照，每張切片作常規(guī)HE染色。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 iNOS表達的判斷標(biāo)準(zhǔn)以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達陽性。綜合染色強度和陽性細胞數(shù)量進行分級。(1)按著色強度積分:基本未著色，染色與背景相似者為0分;著色淺，略高于背景者為1分;中度著色，明顯高于背景者2分;強染，著色深棕色者為3分。(2)按陽性細胞比例積分:在高倍鏡下(×400)隨機選取5個陽性細胞數(shù)多的視野進行計數(shù)，計數(shù)陽性細胞及總細胞數(shù)，求出陽性細胞所占總細胞的百分比，取其平均值，并進行計分:無細胞染色為0分;陽性細胞≤25%為1分;陽性細胞占26%～50%為2分;陽性細胞占51%～75%為3分;陽性細胞＞75%為4分。若兩項積分之和＞2分則判定表達陽性;≤2分判定為表達陰性。

1.4.2 腫瘤微血管密度(MVD)的計數(shù)方法參照Weidner等［3］報道的方法，先在低倍鏡下(100倍)尋找微血管最密集的區(qū)域(hot spot)，通常位于腫瘤的邊緣;然后在高倍鏡(400倍)觀察，以能清楚地與周圍的微血管分開，且被CD34染成棕色的單個血管內(nèi)皮細胞或血管內(nèi)皮細胞叢作為一個可以計數(shù)的微血管。計數(shù)3個高倍鏡的微血管數(shù)目，取均數(shù)作為MVD值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料構(gòu)成比差異用χ2檢驗和Fisher確切概率法檢驗;P≤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MVD與鼻咽癌CD34陽性表達呈棕黃色，位于血管內(nèi)皮細胞的細胞漿和(或)細胞膜中。慢性鼻咽炎組織中微血管均分布在粘膜下結(jié)締組織、淋巴細胞浸潤的組織中(圖1)。鼻咽癌組織中微血管分布不均，形態(tài)不規(guī)則，腫瘤的邊緣微血管密度最高(圖2)。48例鼻咽癌組織中MVD為27.7±8.88，13例慢性鼻咽炎組織MVD為9.0±3.1，兩組之間有顯著差異(t=7.42，P＜0.05)。MVD與年齡、性別無關(guān)。臨床分期中Ⅲ、Ⅳ期組的MVD顯著高于Ⅰ、Ⅱ期組(P＜0.05)。淋巴轉(zhuǎn)移組的MVD顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組(P＜0.05，)見表1。

圖1 慢性鼻咽炎組織中MVD的分布(×400)

圖2 鼻咽癌組織中MVD的分布(×400)

表1 MVD與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系(ˉx±s)

2.2 iNOS的表達與鼻咽癌慢性鼻咽炎上皮細胞iNOS表達為陰性，間質(zhì)細胞偶有表達iNOS(圖3)。在鼻咽癌組織中iNOS主要表達于鼻咽癌細胞胞質(zhì)中，周圍炎癥細胞偶有表達(圖4)。48例鼻咽癌組織中iNOS陽性表達率為56.25%(27/48)。iNOS的表達與年齡、性別無關(guān)(P＞0.05)，而與臨床分期及是否有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，見表2。由于所得鼻咽癌組織標(biāo)本中91.67%(44/48)為低分化鱗癌，中分化鱗癌和高分化鱗癌較少，后者樣本含量小，對組織學(xué)分化程度無法進行統(tǒng)計處理。

2.3 iNOS的表達與MVD的關(guān)系iNOS的陽性表達組27例MVD為30.0±5.4，iNOS陰性表達組21例MVD為24.0±6.0，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t =3.64，P＜0.05)。

圖3 慢性鼻咽炎組織中iNOS的表達(×400)

圖4 鼻咽癌組織中iNOS的表達(×400)

表2 iNOS與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與其血管形成有密切關(guān)系，甚至有人提出“無血管就無腫瘤”的學(xué)說。Weidner等［4］報道可用測量腫瘤中MVD來評價腫瘤血管生成，MVD是乳腺癌患者的一個獨立的預(yù)后指標(biāo)。此后，國內(nèi)外許多學(xué)者的研究證實了MVD在膀胱癌、胃癌等的預(yù)后價值［5-6］。本研究結(jié)果表明，鼻咽癌組MVD顯著高于慢性鼻咽炎組，且慢性炎癥組織中微血管分布在粘膜下結(jié)締組織及淋巴組織中，而鼻咽癌組織中微血管分布不均，形態(tài)不規(guī)則，多在腫瘤的邊緣處密度最高。臨床分期中Ⅲ、Ⅳ期組的MVD高于Ⅰ、Ⅱ期組，二組間有顯著性差異(P＜0.05)，說明新生的腫瘤血管可增大腫瘤細胞進入血循環(huán)的機率，新生血管越多，表明能誘導(dǎo)血管生成的腫瘤細胞數(shù)量越多;頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MVD高于頸淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，二組間有顯著性差異(P＜0.05)說明MVD與鼻咽癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且MVD越高，鼻咽癌發(fā)生轉(zhuǎn)移機率也越高。由于目前對內(nèi)皮細胞免疫標(biāo)記的抗體尚不能區(qū)分淋巴管及血管，因此可以推測在腫瘤組織內(nèi)所標(biāo)記的新生血管中包含新生淋巴管成分。因為促血管生成因子同樣也可對淋巴管內(nèi)皮具有促分裂和增殖作用，從而誘導(dǎo)淋巴管生成［7］。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是體內(nèi)最小的生物活性物質(zhì)之一。iNOS合成的NO可以通過抑制細胞DNA復(fù)制降低呼吸鏈中關(guān)鍵酶的活性，也可以通過生成具有強氧化性的OH·自由基途徑而發(fā)揮細胞毒性作用，造成DNA鏈的斷裂、交叉聯(lián)結(jié)等多種DNA損傷;或通過氧化應(yīng)激形成過氧化亞硝酸鹽造成DNA損傷，從而引起基因突變［8］。此外，Ambs等［9］研究結(jié)腸癌中iNOS與p53表達相關(guān)關(guān)系，認為iNOS與p53表達之間有顯著相關(guān)性，iNOS表達可導(dǎo)致p53基因突變。而野生型p53基因合成的蛋白作為細胞生長的監(jiān)控器，監(jiān)控著體內(nèi)基因組的穩(wěn)定，它能識別DNA損傷，讓細胞停留在G1期，使得細胞有足夠的時間進行修復(fù)或凋亡，從而消除可能致癌的異常細胞。本研究結(jié)果表明，iNOS在鼻咽癌組織中表達率為56.25%，而在慢性鼻咽炎組織中不表達。故推測NOS可能在分子水平參與了鼻咽癌的發(fā)病機制，效應(yīng)分子即為具有細胞毒性作用的NO。

本組研究顯示iNOS的表達與年齡、性別無關(guān)，而在不同的臨床分期中iNOS表達具有顯著差異，Ⅲ、Ⅳ期組iNOS的陽性表達率為70.97%，顯著高于Ⅰ、Ⅱ期組29.41%(P＜0.05)。并且淋巴轉(zhuǎn)移組iNOS的陽性表達率為65.79%顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組20.00%(P＜0.05)。表明iNOS與鼻咽癌的生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一般認為NO在腫瘤進展中起著雙刃劍的作用，與腫瘤組織局部NO密度［10］、腫瘤類型［11］等有關(guān)。持續(xù)低濃度(10-9mol ·g-1或10-12mol·g-1)的NO作為腫瘤細胞信號傳導(dǎo)途徑中重要的信使分子，調(diào)節(jié)與細胞增殖相關(guān)基因的表達，增加腫瘤血供和血管生成，促進腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。高濃度(10-6mol·g-1)的No可以通過與活性中心Fe-S部位結(jié)合使細胞代謝關(guān)鍵酶如三羧酸循環(huán)中的順烏頭酸酶等失活從而影響細胞的能量代謝［12］;與超氧陰離子結(jié)合生成氧自由基造成DNA損傷等從而產(chǎn)生細胞毒性［13-14］;介導(dǎo)巨噬細胞活化而抗腫瘤［15］等途徑抗腫瘤。本組實驗顯示iNOS的陽性表達組27例MVD的30.0±5.4，iNOS陰性表達組45例MVD為24.0±6.0，兩組間有顯著性差異(P＜0.05)。提示鼻咽癌組織中腫瘤細胞內(nèi)有iNOS產(chǎn)生的NO處于相對較低水平，促進鼻咽癌血管生成，進而促進鼻咽癌的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。

以上研究表明，NO在鼻咽癌的發(fā)病、生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的很多方面發(fā)揮作用，開發(fā)NO供體藥物和iNOS特異性抑制劑，并與放療、化療、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑恰當(dāng)?shù)亟Y(jié)合運用，必將為鼻咽癌治療帶來可喜前景。

［1］黃選兆，汪吉寶.實用耳鼻咽喉科學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:6.

［2］Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?［J］.J Natlcancer Inst，1990，82(1):4-6.

［3］Weider N，Semple J，Welch W，et al.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl J Med，1991，324.

［4］Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis:a new significant and independent indicator in early-stage breast carcinoma［J］.J Natl Cancer Inst，1992;84:1875-1887.

［5］Crew JP.o’Brien T，Bradburn M，et al.Vascular endothelial growth factor is a predictor of relapse and stage progression in superficial bladder cancer［J］.Cancer Res，1997，57(23):5281 5285.

［6］Maeda K，Cheung YS，Ogawa Y，et al.Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma［J］Cancer，1996，77(5):858 8631.

［7］Thomsen LL，Miles DW，Happerfield L，et al.Nitric oxide synthase activity in human breast cancer［J］.Br Cancer，1995，72 (1):41-44.

［8］Sagar SM，Singh G，Hodson DI.Nitric oxide and anti-cancer therapy［J］.Cancer Treat Rev，1995，21:159-181.

［9］Ambs S，Merriam WG，Bennett WP，et al.Frequent nitric oxide synthase-2 expression in human colon adenomas:implication for tumor angiogenesis and colon cancer progression［J］.Cancer Res，1998，58:334-341.

［10］Jenkins DC，Charles IG，Thomsen LL，et al.Roles of nitric oxide in tumor growth［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995;92 (10)：4392.

［11］Manabu Nishikawa1，BaoJun Chang，et al.Inducible NO synthase inhibits the growth of free tumor cells，but enhances thegrowth of solid tumors［J］.Carcinogenesis，2004，25(11):2101-2105.

［12］Moncada S，Palmer RM，Higgs EA.Nitric oxide:physiology，pathophysiology，and pharmacology［J］.Pharmacol Rev，1991，43(2):109-142.

［13］Soliman MK，Mazzio E，Soliman KF.Levodopa modulating effects of inducible nitric oxide synthase and reactive oxygen species in glioma cells［J］.Life Sci，2002，72(2):185-198.

［14］Lala PK，Chakraborty C.Role of nitric oxide in carcinogenesis and tumour progression［J］.Lancet Oncol，2001，2(3):149-156.

［15］白蓮花，于春，顧芳，等.新城雞瘟病毒激活的鼠巨噬細胞對肝癌細胞(H_(22))殺傷作用的探討［J］.癌癥，1998，17(4): 262-264.

Relationship between iNOS expression and angiogenesis in nasopharyngeal carcinoma

LIU Ru-yang1GAO Guo-fen2DU Zhi-hua1
(1.Dept.of Otorhinolaryngology，Taishan Medical University，Taian，271000，China; 2.Dept.of Otorhinolaryngology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China)

Objective:To explore the relationship between angiogenesis and biological behavior of nasopharyngeal carcinoma(NPC)，the relationship between the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)and biological behavior of NPC and the relationship between the expression of iNOS and angiogenesis of NPC.Methods:The expression of iNOS and micro vessel density(MVD)were assessed by immunohisto±chemical methods in 48 specimens of NPC and in 13 specimens of chronic nasopharyngitis.The immuno-staining results and related chinical-pathological materials were analyzed by statistical methods.Results:MVD in NPC was significantly higher than that in chronic nasopharyngitis tissues(27.7± 8.88 vs 9±3.1，P＜0.05).MVD in NPC was not related to such factors as age and gender.MVD ofⅢandⅣstages was higher than that ofⅠandⅡstages(30.7±4.7 vs 22.2±7.5，P＜0.05).MVD of cases with lymphatic metastasis was significantly higher than that without lymphatic metastasis(29.6±4.8 vs 20.5±4.8，P＜0.05).The positive staining rate of iNOS was 56.25%.The expression iNOS was not related to age and gender.The positive expression rate(70.97%)of iNOS in cases ofⅢandⅣstages was higher than that(29.41%)in cases ofⅠandⅡstages(P＜0.05).The positive expression rate(65.79%)of iNOS in cases with lymphatic metastasis was higher than that(20.00%)without lymphatic metastasis(P＜0.05).MVD in the cases with positive expression of iNOS was higher than in the cases with in the cases with negative expression(30±5.4 vs 24±6.0，P＜0.05).Conclusion:Angiogenesis of NPC is significantly related to the biological behavior of NPC.The expression of iNOS is related to the biological behavior of NPC.The detection of MVD and the expression of iNOS in NPC can be used as indexes to determine the degree of malignancy and prognosis.

nasopharyngeal carcinoma;angiogenesis，MVD;iNOS;immunohistochemistry

R739.62

A

1004-7115(2015)01-0003-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.01.002

2014-11-11)

劉汝洋(1979-)，男，山東泰安人，講師，碩士，主要從事耳鼻咽喉科學(xué)臨床工作。