祁 燕，袁嘉麗，萬春平，趙文娟，陳一紓，邢海晶

(1.云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，云南昆明650000;2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，以氣道炎癥和氣道重建為主要特征，可以預(yù)防和治療的慢性肺部疾病。COPD氣道炎癥以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤為主，其中巨噬細(xì)胞作為參與氣道固有免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，廣泛分布在肺泡內(nèi)及支氣管表面，也是肺部接觸抗原較早、機(jī)會最多的免疫細(xì)胞，在氣道防御反應(yīng)中發(fā)揮吞噬作用的同時(shí)也參與了氣道炎癥的形成[1]。氣道反復(fù)的慢性炎癥刺激導(dǎo)致氣道壁組織損傷和異常修復(fù)過程反復(fù)進(jìn)行，在此異常修復(fù)過程中發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)即氣道重建。氣道重建呈進(jìn)行性發(fā)展，最終造成氣道狹窄、氣流受限。所以，防治炎癥是COPD長期以來的重點(diǎn)和難點(diǎn)。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到細(xì)菌內(nèi)毒素等因素刺激時(shí)被激活會釋放一系列細(xì)胞因子如一氧化氮(NO)、轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF－β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP－9)等參與 COPD氣道炎癥及氣道重建等病理過程[2－4]。三七總皂苷是我國名貴中藥三七的主要活性成分，其可加快血流速度，降低血液黏度，改善機(jī)體微循環(huán);可緩解支氣管痙攣，抑制炎癥反應(yīng)，改善肺泡通氣功能，促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者的恢復(fù)[5]。其用于治療COPD也獲明顯療效[6－7]。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明，三七總皂苷可降低COPD模型大鼠血清中TGF－β1、MMP－9水平，從而達(dá)到緩解COPD發(fā)展進(jìn)程中氣道炎癥及氣道重建的作用[8]。本研究以前期課題組用三七總皂苷干預(yù)COPD動(dòng)物模型的療效為基礎(chǔ)，采用脂多糖(LPS)激活RAW264.7巨噬細(xì)胞構(gòu)建COPD發(fā)病過程中氣道組織損傷的炎癥細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平觀察三七總皂苷對巨噬細(xì)胞分泌及表達(dá)NO、MMP－9、TGF－β1的作用，以進(jìn)一步探討三七總皂苷防治COPD發(fā)病過程中氣道炎癥及氣道重建的效應(yīng)機(jī)制，為三七總皂苷臨床治療COPD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 藥物 三七總皂苷(注射用血塞通)購自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，400 mg/支，批號:100707。地塞米松注射液購自西南藥業(yè)股份有限公司，5 mg/支，批號:120721。

1.2 細(xì)胞 RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 RPMI－1640培養(yǎng)基購自GibcoBRL公司;胎牛血清購自Hyclone;總RNA提取試劑盒購自天根;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ均購自TaKaRa;引物(TGF－β1，MMP－9)均由大連寶生物工程有限公司合成。恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Trermo公司，型號:3111);ABI PCR儀(Gene公司，型號:Veriti);安捷倫核酸擴(kuò)增熒光檢測儀(Gene公司，型號:MX3000P);Epoch連續(xù)波長酶標(biāo)儀購自美國Bio－Tek公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)傳代至4～5代，處于對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 MTT法測定三七總皂苷對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 RAW264.7細(xì)胞以1×109L－1接種于96孔板，每孔100 μL。細(xì)胞分為 3組:三七總皂苷組每孔加入不同濃度的三七總皂苷藥液(10，30，100，300，900，2700 μg/mL)，地塞米松組每孔加入100 μg/mL地塞米松，正常對照組以1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。每組3個(gè)復(fù)孔，以37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后每孔加入終濃度5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后在酶標(biāo)儀上570 nm處測各孔的吸光值(OD)。

1.4.3 Griess法測定RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的含量 RAW264.7細(xì)胞分為正常對照組(以1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng))、LPS組(1 μg/mL LPS)、LPS+三七總皂苷不同濃度組(1 μg/mL LPS+10，30，100，300 μg/mL 三七總皂苷)、LPS+地塞米松組(1 μg/mL LPS+100 μg/mL地塞米松)。細(xì)胞以1×109L－1接種于96孔板，每孔100 μL，每組重復(fù)3孔，同時(shí)按照分組加入對應(yīng)濃度藥物50 μL置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h 后，再加入1 μg/mL LPS 50 μL 以激活 RAW264.7 細(xì)胞。24 h后收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，置于－20℃待測。檢測時(shí)以50 μL培養(yǎng)液上清與100 μL Griess混合試劑[1%對氨基苯磺酸溶液+0.1%N－(1－萘基)乙二胺二鹽酸鹽溶液等體積]充分混合、振搖10 min，酶標(biāo)儀上540 nm處測量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO釋放量。

1.4.4 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TGF－β1、MMP－9含量檢測 細(xì)胞分組及給藥同1.4.3，取細(xì)胞培養(yǎng)上清后按照酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒說明書檢測上清中 TGF－β1及MMP－9含量。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 RAW264.7細(xì)胞TGF－β1mRNA、MMP－9mRNA水平 RAW264.7細(xì)胞以1×109L－1接種于6孔板，每孔1 mL。細(xì)胞分組及給藥同1.4.3，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后每孔細(xì)胞加入1 mL trizol提取試劑提取細(xì)胞總RNA，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，采用SYBR GreenI嵌合熒光法于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，以小鼠β－actin基因?yàn)閮?nèi)參對照。反應(yīng)體系為:SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL ，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 2μL，ddH2O 8.5 μL 擴(kuò)增條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。用2－ΔΔCT計(jì)算基因相對表達(dá)量。根據(jù)基因庫中基因序列設(shè)計(jì)TGF－β1、MMP－9基因及內(nèi)參基因β－actin引物，各基因引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。均值間差異比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RAW264.7細(xì)胞增殖情況 三七總皂苷在10～300 μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞增殖情況與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，900 μg/mL和2700 μg/mL細(xì)胞增殖情況與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)，見表2。提示三七總皂苷在10～300 μg/mL范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性作用，可在此劑量范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 Q－PCR引物序列

表2 各組RAW264.7細(xì)胞增殖情況(±s)

表2 各組RAW264.7細(xì)胞增殖情況(±s)

注:①與正常對照組比較，P＜0.01。

組別 n 濃度/(μg/mL) OD值正常對照組31.598 ±0.232三七總皂苷組 3103010030090027001.554 ±0.0951.588 ±0.0251.661 ±0.2971.720 ±0.1040.866 ±0.094①0.361 ±0.016①地塞米松組31001.528 ±0.077

2.2 各組RAW264.7細(xì)胞NO釋放情況 LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量顯著高于正常對照組(P＜0.01)。三七總皂苷100，300 μg/mL組和地塞米松組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量顯著低于LPS組(P均＜0.01)。見表3。

表3 各組RAW264.7細(xì)胞NO釋放情況(±s)

表3 各組RAW264.7細(xì)胞NO釋放情況(±s)

注:①與正常對照組比較，P ＜0.01;②與 LPS組比較，P ＜0.01。

組別 n 濃度/(μg/mL) NO/(μmol/mL)正常對照組36.530 ±0.505 LPS 組 3117.116 ±0.532①LPS+三七總皂苷組 3103010030017.859 ±0.74516.610 ±0.37314.695 ±0.475②12.937 ±0.339②LPS+地塞米松組 310013.607 ±0.612①

2.3 各組RAW264.7細(xì)胞上清中TGF－β1、MMP－9分泌情況 LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF－β1、MMP－9含量顯著高于正常對照組(P＜0.05或P＜0.01)。LPS+三七總皂苷100，300 μg/mL組及LPS+地塞米松組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF－β1含量顯著低于LPS組(P均＜0.05);LPS+三七總皂苷300 μg/mL組、LPS+地塞米松組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP－9含量顯著低于 LPS組(P＜0.01或P＜0.05)。見表4。

2.4 各組RAW264.7細(xì)胞TGF－β1mRNA、MMP－9mRNA表達(dá)情況 檢測所提取樣本總 RNA A260/A280在1.8～2.0，RNA較純，無蛋白質(zhì)污染，內(nèi)參及目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99，擴(kuò)增效率90%～120%，內(nèi)參及目的基因溶解曲線峰形單一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。Real－time PCR檢測結(jié)果顯示，LPS組中TGF－β1mRNA、MMP－9 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常對照組(P均＜0.05)。LPS+三七總皂苷300 μg/mL組、LPS+地塞米松組MMP－9 mRNA表達(dá)量明顯低于 LPS組(P均 ＜0.05);LPS+三七總皂苷100，300 μg/mL組及LPS+地塞米松組TGF－β1mRNA表達(dá)量明顯低于LPS組(P＜0.05或P＜0.01)。見表5。

表4 各組RAW264.7細(xì)胞上清中TGF－β1、MMP－9分泌情況(±s)

表4 各組RAW264.7細(xì)胞上清中TGF－β1、MMP－9分泌情況(±s)

注:①與正常對照組比較，P＜0.05;②與正常對照組比較，P＜0.01;③與 LPS組比較，P ＜0.05;④與 LPS組比較，P ＜0.01。

組別 n 濃度/(μg/mL) TGF－β1/(ng/mL) MMP－9/(ng/mL)正常對照組322.539±0.55112.809±0.861 LPS組 3130.971±1.292① 17.165±0.941②LPS+三七總皂苷組 3103010030025.961±0.39826.889±0.67623.371±0.423③22.656±0.531③16.072±1.22615.756±0.49515.187±1.01512.594±0.754④LPS+地塞米松組 310020.697±1.852③ 13.192±1.261③

表5 各組RAW264.7細(xì)胞TGF－β1mRNA、MMP－9 mRNA表達(dá)情況(±s)

表5 各組RAW264.7細(xì)胞TGF－β1mRNA、MMP－9 mRNA表達(dá)情況(±s)

注:①與正常對照組比較，P＜0.05;②與 LPS組比較，P＜0.05;③與 LPS組比較，P ＜0.01。

組別 n 濃度/(μg/mL) TGF－β1mRNA MMP－9 mRNA正常對照組31.001.00 LPS組 311.90±0.073① 2.59 ±0.319①LPS+三七總皂苷組 310301003001.52±0.2101.45 ±0.2551.31±0.164②0.95 ±0.4961.95 ±0.0892.09 ±0.2032.06 ±0.4391.47 ±0.090②LPS+地塞米松組 31000.99±0.179③ 1.56±0.095②

3 討論

巨噬細(xì)胞的激活是炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)，LPS等激活巨噬細(xì)胞后在酶的催化下合成過量的NO[9]，可介導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺組織的炎性滲出及肺泡的損傷。研究報(bào)道COPD患者NO的生成及釋放增多，測定NO升高可提示存在氣道炎癥[10]。巨噬細(xì)胞激活后分泌過高的MMP－9對炎性細(xì)胞有趨化作用，可促進(jìn)炎癥發(fā)展，更為重要的是MMP－9可降解細(xì)胞外基質(zhì)，使肺泡結(jié)構(gòu)破壞，參與COPD氣道重建過程，導(dǎo)致氣流阻塞。對COPD動(dòng)物模型及COPD患者的研究表明，其體內(nèi)肺組織、血液中MMP－9表達(dá)水平均升高[11－12]。此外巨噬細(xì)胞分泌的TGF－β1是氣道重建的主要調(diào)控因子[13]，其表達(dá)增高，可引起氣道上皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，肌成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的膠原合成活性，故促進(jìn)氣道膠原沉積和基底膜增厚，促進(jìn)結(jié)締組織蛋白合成[14－16]，在氣道重建中發(fā)揮重要作用，最終可導(dǎo)致氣道狹窄和不可逆的肺功能改變。因此，能拮抗巨噬細(xì)胞分泌NO、MMP－9、TGF－β1的藥物可能減輕氣道炎癥反應(yīng)，延緩氣道重建過程，減緩COPD的發(fā)病。

本研究通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)三七總皂苷在10～300 μg/mL范圍內(nèi)未對細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性作用;未經(jīng)LPS刺激的正常對照組NO、MMP－9、TGF－β1分泌較少，且 MMP－9、TGF－β1mRNA 表達(dá)較低，加入 LPS刺激后，NO、MMP－9、TGF－β1釋放量顯著增加，MMP－9、TGF－β1mRNA表達(dá)亦上調(diào)，表明LPS能夠誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞過度激活，釋放炎癥相關(guān)遞質(zhì)。經(jīng)三七總皂苷干預(yù)后，三七總皂苷100 μg/mL組和300 μg/mL組與 LPS組相比，NO、MMP －9、TGF － β1含量均降低 ，MMP－9、TGF－β1mRNA表達(dá)亦明顯下調(diào)，提示三七總皂苷能夠從細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)錄水平上抑制 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的功能。

綜上所述，三七總皂苷可能是通過下調(diào) NO、TGF－β1、MMP－9的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，從而推測此途徑可能是其臨床治療COPD獲效的作用機(jī)制之一，而要明確三七總皂苷治療COPD的分子調(diào)控體系、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚需進(jìn)一步深入研究，這也是今后積極研究的方向。

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