梁存喜

基因工程和細(xì)胞工程是高考的重點(diǎn)，其中多處涉及到篩選問(wèn)題，由于教材的介紹比較簡(jiǎn)略，很多學(xué)生對(duì)篩選的方法和原理不甚理解，在此結(jié)合具體的題目，對(duì)基因工程中目的基因和重組細(xì)胞的篩選以及細(xì)胞工程中雜種細(xì)胞的篩選進(jìn)行分析，以期對(duì)學(xué)生的學(xué)習(xí)有所幫助.

一、基因工程中的篩選

1.利用DNA探針從基因文庫(kù)中篩選目的基因

例1為從根本上解決水稻中的高植酸問(wèn)題，可將植酸酶基因?qū)胨?，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種.圖1是獲取植酸酶基因的流程.據(jù)圖回答：

圖1（1）圖中基因組文庫(kù)（小于/等于/大于）cDNA文庫(kù).（2）B過(guò)程需要的酶是；A、C過(guò)程中（可以/不可以）使用同一種探針篩選含目的基因的菌株.（3）目的基因Ⅰ和Ⅱ除從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中和為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該過(guò)程中所用酶的顯著特點(diǎn)是.

解析基因組文庫(kù)是從酵母菌體內(nèi)直接提取DNA構(gòu)建的，cDNA文庫(kù)是由酵母菌細(xì)胞中提取的mRNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，由于酵母菌細(xì)胞內(nèi)可能只有部分基因表達(dá)產(chǎn)生mRNA，因此基因組文庫(kù)大于cDNA文庫(kù).B過(guò)程需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶；因?yàn)锳、C過(guò)程都能獲得含目的基因的菌株，所以可以使用同一種探針進(jìn)行篩選.目的基因Ⅰ和Ⅱ除從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中DNA和cDNA為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該過(guò)程中所用的酶是耐高溫的RNA聚合酶.

答案：（1）大于（2）逆轉(zhuǎn)錄酶可以

（3）DNAcDNA耐高溫

知識(shí)鏈接基因文庫(kù)包括基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù).基因文庫(kù)是一套包含特定生物體所有基因的DNA序列.其中，不同的DNA序列片段分別被克隆在適當(dāng)?shù)妮d體上.例如，人類(lèi)基因文庫(kù)是一群帶有人類(lèi)基因克隆的大腸桿菌細(xì)胞.那么我們?nèi)绾螐倪@個(gè)文庫(kù)中篩選出所需要的目的基因呢？目前，有很多

圖4（1）該放射性物質(zhì)中被標(biāo)記的元素是 .光合作用過(guò)程中，含標(biāo)記元素的化合物被光反應(yīng)提供的 還原成糖類(lèi).在適宜溫度下測(cè)得葉片光飽和點(diǎn)，若其他條件不變，進(jìn)一步提高溫度，則該葉片光飽和點(diǎn)的變化是 .（2）由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，幼鈴脫落顯著減少的是 組.B組幼鈴放射性強(qiáng)度百分比最低，說(shuō)明B組葉片的光合產(chǎn)物 .為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，增設(shè)了D組（激素處理葉片），各組幼鈴的放射性強(qiáng)度百分比由高到低排序是 .由此可知，正確使用該激素可改善光合產(chǎn)物調(diào)配，減少棉鈴脫落.（3）若該激素不能促進(jìn)插條生根，卻可促進(jìn)種子萌發(fā)和植株增高，其最可能是 .

答案：（1）碳；NADPH（[H]）；降低 （2）C；輸出減少；C>A>B>D （3）赤霉素

創(chuàng)新之處考查了外源激素對(duì)植物光合產(chǎn)物調(diào)配的影響.

解析（1）光合產(chǎn)物用碳元素標(biāo)記.光反應(yīng)提供的[H]還原C3為糖類(lèi)和C5.適宜溫度下若提高溫度，酶活性降低，光飽和點(diǎn)降低.（2）幼鈴脫落是光合產(chǎn)物不足導(dǎo)致，C組幼鈴中有機(jī)物占比最高，因而幼鈴脫落顯著減少.B組中葉片的放射性強(qiáng)度的百分比較高，說(shuō)明有機(jī)物占比較多，輸出較少.由題中數(shù)據(jù)可知，激素可抑制葉片有機(jī)物的輸出，有利于幼鈴有機(jī)物的輸入，D組導(dǎo)致葉片有機(jī)物輸出明顯較少，且小于B組，因而幼鈴的放射性強(qiáng)度百分比由高到低依次為C>A>B>D.（3）促進(jìn)種子萌發(fā)和植株增高，但不能促進(jìn)扦插枝條生根的激素，最可能是赤霉素.（收稿日期：2014-09-20）方法能夠幫助我們從基因文庫(kù)的眾多克隆中篩選和鑒定帶有特定基因的克隆，這些方法大多是以雜交探測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)的.雜交探測(cè)是一種利用能和目的基因序列互補(bǔ)的DNA片段為探針，通過(guò)分子雜交的手段找出帶有目的基因的DNA片段的實(shí)驗(yàn)方法.DNA探針是根據(jù)已知的有關(guān)目的基因的某些信息（部分DNA序列或蛋白質(zhì)產(chǎn)物等）通過(guò)化學(xué)方法合成的核苷酸單鏈，制作DNA探針時(shí)，可利用目的基因的部分核苷酸序列，而無(wú)需使用全部的核苷酸序列， 因此雖然mRNA形成過(guò)程中存在加工過(guò)程，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄后獲得的DNA可能和原DNA不完全相同，但仍可用同一種探針進(jìn)行檢測(cè).探針要利用放射性元素或熒光色素進(jìn)行標(biāo)記以利于檢測(cè).

2.利用標(biāo)記基因篩選重組細(xì)胞

例2目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如圖2-a所示.

圖2（1）構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)要有抗性基因，以便于.（2）現(xiàn)將pBR322質(zhì)粒和目的基因經(jīng)BamHⅠ處理后構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，為檢測(cè)重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無(wú)ampr和tetr的大腸桿菌體內(nèi)，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖2-b的菌落.再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖2-c的結(jié)果（空圈表示與圖2-b對(duì)照無(wú)菌落的位置）.與圖2-c空圈相對(duì)應(yīng)的圖2-b中的菌落表現(xiàn)型是，圖2-c的結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是.

解析（1）構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)要有抗性基因作為標(biāo)記基因，以便于篩選（鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞）.（2）在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠生長(zhǎng)的大腸桿菌具有氨芐青霉素抗性基因，這些大腸桿菌中導(dǎo)入了pBR322質(zhì)?；蛑亟MpBR322質(zhì)粒.經(jīng)BamHⅠ處理后，pBR322質(zhì)粒中的四環(huán)素抗性基因被破壞.因此在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠生長(zhǎng)的大腸桿菌具有四環(huán)素抗性基因，這些大腸桿菌中導(dǎo)入了pBR322質(zhì)粒而沒(méi)有導(dǎo)入重組pBR322質(zhì)粒.能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的是導(dǎo)入了重組pBR322質(zhì)粒的大腸桿菌，而既能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)又能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的只能是導(dǎo)入了pBR322質(zhì)粒的大腸桿菌.綜上分析可知，與圖2-c空圈相對(duì)應(yīng)的圖2-b中的菌落是只能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸桿菌，表現(xiàn)型是能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素.圖2-c的結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌既能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，又能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，導(dǎo)入的是pBR322質(zhì)粒.

答案：（1）篩選（鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞） （2）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素 pBR322質(zhì)粒

知識(shí)鏈接用同種限制性核酸內(nèi)切酶處理的目的基因和運(yùn)載體具有相同的黏性末端，在DNA連接酶的作用下，如果只考慮兩個(gè)DNA片段兩兩結(jié)合，混合物中至少有3種環(huán)狀DNA：質(zhì)粒自連的環(huán)狀DNA（普通質(zhì)粒）、目的基因自連的環(huán)狀DNA、質(zhì)粒與目的基因相連的環(huán)狀DNA（重組質(zhì)粒）.由此可見(jiàn)，經(jīng)DNA連接酶處理后，并不能保證每一個(gè)質(zhì)粒都能與目的基因?qū)崿F(xiàn)重組，因此導(dǎo)入受體細(xì)胞的不一定是基因工程所需要的重組質(zhì)粒，也可能是普通質(zhì)粒，這就需要對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行篩選.

通常在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)就要考慮到篩選的需要，質(zhì)粒上需要具有特定的標(biāo)記基因以利于篩選.例2中的pBR322質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因（圖2-a），因此含有普通pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞具有對(duì)四環(huán)素和氨芐青霉素的雙重抗性.如果目的基因插入到四環(huán)素抗性基因中，四環(huán)素抗性基因就會(huì)被破圖3壞，對(duì)四環(huán)素的抗性就會(huì)喪失，所以帶有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞僅對(duì)氨芐青霉素具有抗性，對(duì)四環(huán)素沒(méi)有抗性.根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)可篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞.篩選時(shí)首先要用一小塊滅菌的絨布固定在直徑較平板略小的圓柱形木塊上，制作一個(gè)“印章”（即接種工具，如圖3），然后采用例2第（2）小題所述的方法進(jìn)行，最后從圖2-c空圈相對(duì)應(yīng)的圖2-b中的菌落處分離得到所需的含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞.

二、細(xì)胞工程中的篩選

1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)中篩選雜種細(xì)胞

例3現(xiàn)有甲、乙兩個(gè)煙草品種（2N=48），其基因型 分別為rrHH和RRhh，這兩對(duì)基因位于非同源染色體上，且在光照強(qiáng)度大于800勒克斯時(shí)，都不能生長(zhǎng)，這是由于它們中的一對(duì)隱性純合基因（rr或hh）作用的結(jié)果.取兩品種的花藥離體培養(yǎng)成植株，然后將它們的葉肉細(xì)胞制成原生質(zhì)體，并將兩者相混，使之融合（只考慮2個(gè)原生質(zhì)體的相互融合），誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán).（1）實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)必須用 除去不利于原生質(zhì)體融合的物質(zhì).（2）實(shí)驗(yàn)中除獲得雜種細(xì)胞外，還有基因型為 的融合細(xì)胞.（3）設(shè)計(jì)一方法（不考慮機(jī)械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細(xì)胞，方法： .在此條件下，有種細(xì)胞團(tuán)不能分化；能分化的細(xì)胞團(tuán)是由的原生質(zhì)體融合來(lái)的.由該細(xì)胞團(tuán)分化發(fā)育成的植株，其染色體數(shù)是，基因型是.

解析制備原生質(zhì)體利用酶解法，即用果膠酶和纖維素酶水解細(xì)胞壁；花藥離體培養(yǎng)形成單倍體植株，利用其葉肉細(xì)胞制成的原生質(zhì)體基因型分別是rH和Rh，如果只考慮兩兩融合的情況，除獲得雜種細(xì)胞外，還有原生質(zhì)體自身融合而成的，基因型分別是rrHH、RRhh；由于隱性純合基因rr或hh的作用，在光照強(qiáng)度大于800勒克斯時(shí)不能生長(zhǎng)，因此可將融合后的細(xì)胞置于大于800勒克斯光照下培養(yǎng)，自身融合的rrHH、RRhh不能生長(zhǎng)，只有基因型為RrHh的雜種細(xì)胞能夠生長(zhǎng).

答案：（1）纖維素酶和果膠酶 （2）rrHH、RRhh （3）置于大于800勒克斯光照下培養(yǎng)，收集能生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán) 2 甲乙兩品種 48 RrHh

知識(shí)鏈接雜種細(xì)胞的篩選沒(méi)有通用的方法，一般根據(jù)需要篩選的細(xì)胞特點(diǎn)進(jìn)行.篩選可以用機(jī)械方法，也可以用生理學(xué)或遺傳學(xué)的方法.

2.單克隆抗體制備過(guò)程中的篩選

例4已知細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷.人淋巴細(xì)胞中雖有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖.鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒(méi)有S途徑，但能不斷分裂增殖，將這兩種細(xì)胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細(xì)胞：

（1）試管中除融合的雜種細(xì)胞外，還有 種融合細(xì)胞（只考慮兩個(gè)細(xì)胞的融合）.

（2）設(shè)計(jì)一方法（不考慮機(jī)械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細(xì)胞，并說(shuō)明原理.

方法： .原理： .

（3）欲制備治療H7N9禽流感的單克隆抗體，已知人B淋巴細(xì)胞（染色體組成為2N=46），鼠骨髓瘤細(xì)胞（染色體組成為2N=40）.那么B淋巴細(xì)胞應(yīng)取自于 （正常個(gè)體、患者），雜交瘤細(xì)胞中共有 個(gè)染色體組.

解析（1）將人的淋巴細(xì)胞和鼠的骨髓瘤細(xì)胞混合后加入聚乙二醇促融，如果只考慮兩個(gè)細(xì)胞的融合，則試管中除雜種細(xì)胞外，還有2種自身融合細(xì)胞；（2）由題意可知，D途徑可被氨基蝶呤阻斷，故在培養(yǎng)基中加入氨基蝶呤后，只有D途徑的骨髓瘤細(xì)胞不能進(jìn)行DNA復(fù)制而不能分裂增殖，B淋巴細(xì)胞雖然有S途徑，但是B細(xì)胞一般不分裂增殖，只有雜交瘤細(xì)胞中可利用B細(xì)胞的S途徑進(jìn)行DNA合成而不斷增殖.（3）患者體內(nèi)可分化出能夠分泌抗H7N9禽流感病毒抗體的漿細(xì)胞，故所需B淋巴細(xì)胞應(yīng)取自患者，人和鼠都是二倍體，因此雜交瘤細(xì)胞中含有4個(gè)染色體組.

答案：（1）2 （2）培養(yǎng)液中加入氨基蝶呤，收集增殖的細(xì)胞；加入氨基蝶呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞中可以利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖.（3）患者 4（4）液體 動(dòng)物血清

知識(shí)鏈接在單克隆抗體的制備中，首先把從脾臟中分離出的B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合以獲得雜交瘤細(xì)胞.

通常采用兩步操作進(jìn)行：第一步采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞.HAT選擇培養(yǎng)基是在普通培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、 氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質(zhì)配制而成的，已知細(xì)胞中DNA的合成存在D和S兩條途徑，其中氨基蝶呤可阻斷D途徑，骨髓瘤細(xì)胞僅有D合成途徑，B淋巴細(xì)胞雖然含有D、S兩條途徑，但是一般不增殖，這就決定了在HAT培養(yǎng)基中只有B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交瘤細(xì)胞可以利用B淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖，其他細(xì)胞不能增殖.由此篩選出的雜交瘤細(xì)胞可能是多種B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合而成的，因此需要進(jìn)行第二次篩選，選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞.二次篩選通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋?zhuān)臃N在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)，通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖，然后利用特定抗原檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），如果上清液可與特定抗原發(fā)生特異性反應(yīng)（陽(yáng)性反應(yīng)），說(shuō)明這個(gè)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞就有我們需要的雜交瘤細(xì)胞.對(duì)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋?zhuān)话阒貜?fù)3～4次，保證每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞，由此獲得 “單克隆抗體”——由一個(gè)細(xì)胞克隆而來(lái)的細(xì)胞群分泌的抗體.第二次篩選同時(shí)也是鑒定的過(guò)程.

（收稿日期：2014-02-03）