努榮古麗買買提，張化冰，邢小平

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京1007302新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，烏魯木齊830001

一例維吾爾族Gitelman綜合征患者的臨床與基因突變分析

努榮古麗買買提1，2，張化冰1，邢小平1

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京1007302新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，烏魯木齊830001

目的 探討1例維吾爾族Gitelman綜合征 (Gitelman's syndrome，GS)患者的臨床表現(xiàn)及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法 詳細(xì)收集患者的臨床資料、生化檢查及影像學(xué)檢查結(jié)果，抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增SLC12A3基因的26個(gè)外顯子及其與內(nèi)含子的交界區(qū)，測(cè)序確定突變情況。結(jié)果 患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查符合GS診斷?；蛲蛔兎治鲲@示，患者SLC12A3基因cDNA序列的第1964位鳥嘌呤G純合突變?yōu)橄汆堰蔄(c.1964 G＞A)，造成第655位氨基酸由精氨酸改變?yōu)榻M氨酸 (p.Arg655His)，該突變位于SLC12A3的第16外顯子。結(jié)論 通過(guò)SLC12A3基因突變分析，從分子遺傳學(xué)方面證實(shí)1例維吾爾族患者GS的診斷。臨床上持續(xù)低血鉀、腎臟失鉀、代謝性堿中毒、血壓正?；蚱汀⒌湍蜮}的患者應(yīng)考慮該疾病診斷，基因分析有助于確診。

Gitelman綜合征;低鉀血癥;SLC12A3基因;噻嗪類敏感的鈉氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;基因突變

Med J PUMCH，2015，6(6):427－431

Gitelman綜 合 征 (Gitelman's syndrome，GS，OMIM 263800)，是以低血鉀、低氯性代謝性堿中毒、低血鎂、低尿鈣、繼發(fā)性醛固酮增多和血壓正?；蚱蜑樘卣鞯募膊　Ｄ壳耙呀?jīng)明確它主要是由位于16號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)3帶 (16q13)的SLC12A3基因突變導(dǎo)致［1］。SLC512A3基因共由26個(gè)外顯子組成，編碼噻嗪類敏感的鈉氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Na-Cl cotransporter，NCC)(NM_000339.2;OMIM 600968)。NCC蛋白由1030個(gè)氨基酸組成，位于腎臟遠(yuǎn)曲小管的管腔面，含12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。NCC蛋白的突變可以導(dǎo)致遠(yuǎn)曲小管對(duì)鈉和氯吸收障礙，進(jìn)而導(dǎo)致尿鉀、氫、鎂丟失增加，而尿鈣排泄減少，引起GS特征性的臨床表現(xiàn)［2］。GS是一種常染色體隱性遺傳疾病，目前在多個(gè)種族，包括漢族人中有過(guò)報(bào)道［3］，但是未見(jiàn)在維吾爾族人群的報(bào)道，對(duì)于不同民族GS臨床表現(xiàn)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)是否存在差異有待進(jìn)一步研究。本研究將分析1例維吾爾族GS患者的臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查和SLC12A3基因突變情況，以對(duì)此行進(jìn)一步探討。

對(duì)象和方法

對(duì)象

北京協(xié)和醫(yī)院收治的1例維吾爾族低鉀血癥患者，經(jīng)體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查后，確診為GS。經(jīng)患者知情同意，北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，抽取外周血，提取基因組DNA進(jìn)行SLC12A3基因分析。

實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查方法

激素測(cè)定和影像學(xué)檢查:甲狀腺功能、促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇、24h尿游離皮質(zhì)醇、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1均采用化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定;完成腹部及腎動(dòng)脈B超、腎上腺CT掃描等檢查。

功能試驗(yàn):(1)臥立位醛固酮試驗(yàn):試驗(yàn)日患者空腹過(guò)夜，清晨4點(diǎn)排尿后平臥，上午8點(diǎn)臥位取血測(cè)腎素活性和醛固酮，然后肌注速尿40 mg，站立2 h，上午10點(diǎn)立位取血測(cè)腎素活性和醛固酮水平。(2)卡托普利試驗(yàn):試驗(yàn)日患者空腹過(guò)夜，清晨4點(diǎn)排尿后平臥，上午8點(diǎn)臥位取血測(cè)腎素活性和醛固酮水平，然后口服卡托普利25 mg，靜臥2 h，上午10點(diǎn)臥位取血測(cè)腎素活性和醛固酮水平。

基因分析方法

基因組DNA提取:采用QIAampDNA Blood Mini Kit試劑盒 (Qiagen，德國(guó))提取，參照試劑盒說(shuō)明提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增SLC12A3基因片段:根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的SLC12A3基因序列 (NC_000016)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增SLC12A3基因的26個(gè)外顯子及其與內(nèi)含子交界區(qū)，引物由天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司合成，PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，52～60℃退火40 s，72℃延伸60 s(表1)，循環(huán)35次;循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物片段大小。

PCR產(chǎn)物直接測(cè)序:采用DNA純化回收試劑盒［天根生化科技 (北京)有限公司］純化回收PCR產(chǎn)物，送諾賽基因公司用 ABI 3700熒光自動(dòng)測(cè)序儀(ABI，美國(guó))測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果分析:測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析 (SLC12A3 cDNA: NM_000339，NCC蛋白:NP_000330)，以確定變異的位點(diǎn)和類型。并進(jìn)一步與NCBI SNP和Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)及人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù) (Human Gene Mutation Database，HGMD)進(jìn)行比對(duì)，排除變異位點(diǎn)為基因多態(tài)性位點(diǎn)并確定其是否為未報(bào)道過(guò)的新突變位點(diǎn)。

結(jié)果

臨床資料

患者35歲，男性，維吾爾族，以“肢體無(wú)力麻木4年”于2012年6月入院。患者于2008年以發(fā)熱為誘因漸漸出現(xiàn)雙手、雙下肢麻木伴無(wú)力，四肢屈曲不能伸直，伴有心慌、胸悶、氣憋不適，急查血鉀2.0 mmol/L，予口服補(bǔ)鉀后癥狀逐漸緩解。第2日復(fù)查血鉀3.02 mmol/L、血鈣2.27 mmol/L、血鎂0.76 mmol/L，動(dòng)脈血?dú)鈖H 7.472，診斷為低鉀血癥，予口服補(bǔ)鉀治療，出院后自覺(jué)癥狀改善，自行停服。2012年2月因皮膚過(guò)敏就醫(yī)，當(dāng)時(shí)無(wú)四肢麻木、肌無(wú)力表現(xiàn)，在住院期間查血鉀2.8 mmol/L，動(dòng)脈血?dú)鈖H 7.472，再次予補(bǔ)鉀治療，每日氯化鉀3 g，為進(jìn)一步確診收住北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科?；颊卟〕讨醒獕赫Ｆ?，100/60 mmHg(1 mm Hg=0.133 kPa)左右，平素口干不明顯，夜尿0～2次，無(wú)腎結(jié)石，大便不干，胃納可，無(wú)嘔吐、腹瀉，體重?zé)o明顯變化。既往無(wú)利尿劑、腎毒性藥物服用史，無(wú)毒物接觸史。家族史:父母近親結(jié)婚，有2姐，育1女，均體健，至今未發(fā)現(xiàn)低血鉀。體格檢查:血壓100/60 mmHg，身高176 cm，體重63 kg，一般情況好，甲狀腺未觸及，雙肺呼吸音清，心率72次/min，齊，雙下肢不腫。

實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查結(jié)果

實(shí)驗(yàn)室檢查:動(dòng)脈血?dú)鈖H 7.466，HCO3－29.1 mmol/L，血鉀2.1 mmol/L、血鈉139 mmol/L、血氯96 mmol/L、血鈣 2.43 mmol/L、血鎂 0.87 mmol/L (正常值0.8～1.0 mmol/L)、肌酐95 mmol/L、血糖4.6 mmol/L，尿常規(guī) (－)，24 h尿鉀48.6 mmol、尿鈉187 mmol、尿鎂6.16 mmol，單次尿尿鈣/肌酐比值0.028 mmol/mmol，尿白蛋白肌酐比值0.62 mg/mmol;甲狀腺功能、促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇、24 h尿游離皮質(zhì)醇、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1均正常。

功能試驗(yàn):臥立位試驗(yàn)中，臥位和立位血漿腎素活性分別為0.43和1.47 ng/(ml·h)，血漿醛固酮水平分別為545和557 pmol/L;卡托普利試驗(yàn)中，服藥前后血漿腎素活性分別為0.82和1.65 ng/(ml·h)，血漿醛固酮水平分別為601和491 pmol/L。

表1 SLC12A3基因擴(kuò)增引物

影像學(xué)檢查:B超示肝膽胰脾未見(jiàn)異常，雙腎腎動(dòng)脈未見(jiàn)異常;腎上腺CT未見(jiàn)異常。

治療

患者完善檢查后予以補(bǔ)鉀治療，每日補(bǔ)充，血鉀維持在3.0～3.5 mmol/L以上?；颊咭话闱闆r可，無(wú)明顯四肢無(wú)力、麻木表現(xiàn)。

SLC12A3基因突變分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):以患者DNA為模板，分別用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳EB染色后，均見(jiàn)一清晰條帶，且與預(yù)期片段大小相符。

基因突變分析:測(cè)序結(jié)果顯示，患者的SLC12A3基因第16外顯子發(fā)生錯(cuò)義突變，為c.1964G＞A純合突變，造成第655位氨基酸由精氨酸改變?yōu)榻M氨酸，即p.Arg655His(圖1)。與NCBI SNP和Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明，SLC12A3 c.1964G＞A不是多態(tài)性位點(diǎn)，在HMGD數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.hgmd.cf.ac.uk/)檢索發(fā)現(xiàn)，c.1964G＞A突變?yōu)榧韧鶊?bào)道過(guò)的突變［1］。

圖1 SLC12A3基因第16外顯子正鏈部分片段的測(cè)序結(jié)果圖箭頭所示為突變位點(diǎn) (c.1964G＞A→p.Arg655His)

討論

本例患者35歲，男性，維吾爾族，因“肢體無(wú)力麻木4年”就診?；颊哂邪Y狀時(shí)血鉀低，明確為低鉀血癥。血鉀低于3.5 mmol/L時(shí)24 h尿鉀大于25 mmol，沒(méi)有進(jìn)食減少、腸道排泄增多、細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移等情況，考慮為腎臟失鉀。患者同時(shí)有代謝性堿中毒，血壓不高，不考慮由于鹽皮質(zhì)激素增多或作用增強(qiáng)導(dǎo)致的失鉀，同時(shí)患者又沒(méi)有嘔吐或使用利尿劑的病史，腎素醛固酮系統(tǒng)檢查提示為繼發(fā)性醛固酮增多癥，應(yīng)該考慮GS或Bartter綜合征 (Bartter syndrome，BS)的診斷。

GS和BS綜合征都是由于腎小管的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生突變，導(dǎo)致鈉和氯重吸收障礙，進(jìn)而引起兩者都具備的低鉀、血壓正常或偏低、繼發(fā)性醛固酮增多等一系列表現(xiàn)，因此最初認(rèn)為GS只是BS的一個(gè)亞型。但是隨著對(duì)疾病遺傳學(xué)和分子機(jī)制研究的深入，目前已經(jīng)明確這兩種疾病有不同的發(fā)病機(jī)制和遺傳學(xué)背景。BS現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)有5種亞型，分別由不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能異常引起;而GS則已經(jīng)明確由SLC12A3基因突變導(dǎo)致噻嗪類敏感的NCC蛋白功能異常所致［2］。由于發(fā)病機(jī)制不同，GS和BS有不同的臨床表現(xiàn)，如GS發(fā)病年齡較晚，癥狀較輕，尿鈣降低。本例患者30歲后才出現(xiàn)癥狀，平時(shí)臨床表現(xiàn)不明顯，尿鈣明顯降低，符合GS的診斷，但是目前發(fā)現(xiàn)BS的Ⅲ型亦可有類似表現(xiàn)［2］，因此基因診斷有助于GS的確診。

GS的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，患者行基因檢測(cè)明確為SLC12A3基因c.1964G＞A純合突變，造成NCC蛋白第655位氨基酸由精氨酸改變?yōu)榻M氨酸，該突變位點(diǎn)已有文獻(xiàn)報(bào)道［1］，因此患者GS診斷明確。但是文獻(xiàn)中對(duì)該突變位點(diǎn)的臨床表現(xiàn)未作詳細(xì)報(bào)道，因此本例報(bào)道有助于進(jìn)一步了解基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系。

目前文獻(xiàn)中已報(bào)道SLC12A3基因突變超過(guò)200種，其中超過(guò)75%為錯(cuò)義突變，沒(méi)有明顯的突變熱點(diǎn)，僅在中國(guó)人中發(fā)現(xiàn)Thr60Met是最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)［2］。本例患者為近親結(jié)婚，可能患者父母均攜帶相同雜合突變，而雜合突變并不會(huì)引起患病，因此父母并沒(méi)有臨床表現(xiàn)。目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SLC12A3基因型與表現(xiàn)型有明確的關(guān)系，有文獻(xiàn)提示血鎂與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)［4］，患者的血鎂水平正常，與患者病情較輕的表現(xiàn)符合。

目前亞洲患者包括中國(guó)漢族患者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GS突變有50種以上［3，5-6］，在中國(guó)健康人群中的研究提示SLC12A3基因雜合突變比例達(dá)約3%［7］，但之前未見(jiàn)維吾爾族人群的報(bào)道，本例可能為首次報(bào)道維吾爾族的GS患者，說(shuō)明維吾爾族人群同樣存在SLC12A3基因的突變。

總之，GS是由SLC12A3基因突變導(dǎo)致的一種少見(jiàn)遺傳疾病，臨床上持續(xù)低血鉀、腎臟失鉀、代謝性堿中毒、血壓正?；蚱汀⒌湍蜮}應(yīng)考慮該疾病診斷，基因分析有助于確診。

［1］Simon DB，Nelson-Williams C，Bia MJ，et al．Gitelman's variant of Bartter's syndrome，inherited hypokalaemic alkalosis，is caused by mutations in the thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter［J］．Nat Genet，1996，12:24-30．

［2］Al Shibli A，Narchi H．Bartter and Gitelman syndromes: Spectrum of clinical manifestations caused by different mutations［J］．World J Methodol，2015，5:55-61．

［3］Wang L，Dong C，Xi YG，et al．Thiazide-sensitive Na+-Clcotransporter:genetic polymorphisms and human diseases［J］．Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2015，47:325-334．

［4］Jiang L，Chen C，Yuan T，et al．Clinical severity of Gitelman syndrome determined by serum magnesium［J］．Am J Nephrol，2014，39:357-366．

［5］Li C，Zhou X，Han W，et al．Identification of two novel mutations in SLC12A3 gene in two Chinese pedigrees with Gitelman syndrome and review of literature［J］．Clin Endocrinol(Oxf)，2015，doi:10.1111/cen.12820．

［6］Luo J，Yang X，Liang J，et al．A pedigree analysis of two homozygous mutant Gitelman syndrome cases［J］．Endocr J，2015，62:29-36．

［7］Shao L，Ren H，Wang W，et al．Novel SLC12A3 mutations in Chinese patients with Gitelman's syndrome［J］．Nephron Physiol，2008，108:29-36．

Clinical and Genetic Analysis of a Uyghur Patient with Gitelman's Syndrome

MAIMAITI Nu-rong-gu-li1，2，ZHANG Hua-bing1，XING Xiao-ping1

1Department of Endocrinology，Key Laboratory of Endocrinology of Ministry of Health，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China2Department of Endocrinology，Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830001，China

ObjectiveTo analyze the clinical manifestations and molecular basis of a Uyghur patient with Gitelman's syndrome(GS)．MethodsClinical features，laboratory data，and imaging results of this patient were collected．Genomic DNA was extracted from leukocytes of peripheral blood of the patient．Twenty-six exons of the GS gene and their boundaries with introns were amplified by polymerase chain reaction(PCR)．The mutations of the SLC12A3 gene were identified by direct sequencing．ResultsGS was diagnosed based on comprehensive consideration of clinical presentations，laboratory test results，and imaging findings．Gene mutation test revealed a nucleotide substitution of adenine for guanine at the position 1964 of cDNA sequence of SLC12A3 gene (c.1964 G＞A)，which caused a missense mutation of arginine to histidine at codon 655(p.Arg655His)．It occurred at the 16th exon of SLC12A3．ConclusionsSLC12A3 gene mutation analysis confirms the diagnosis of GS in this Uyghur patient from the aspect of molecular genetics．GS should be suspected in patients with persisting hypokalemia，renal potassium loss，metabolic alkalosis，normal or low-than-normal blood pressure，andhypocalcuria．Genetic analysis of SLC12A3 may be helpful to confirm the diagnosis．

Gitelman's syndrome;hypokalemia;SLC12A3 gene;thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter;gene mutation

ZHANG Hua-bing Tel:010-69155073，E-mail:huabingzhang@yahoo．com

R589.4;R589.5;R692.6

A

1674-9081(2015)06-0427-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2015.06.006

2015-07-23)

張化冰 電話:010-69155073，E-mail:huabingzhang@yahoo．com

國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目 (WBYZ2011-873);北京協(xié)和醫(yī)院中青年科研基金 (pumch-2013-060)