黃立搜 樓黎明 王世強(qiáng) 胡丹丹 陳素珍 徐一凱 章 潛

膿毒癥大鼠急性肺損傷機(jī)制研究

黃立搜 樓黎明 王世強(qiáng) 胡丹丹 陳素珍 徐一凱 章 潛

目的 探討膿毒癥大鼠急性肺損傷的機(jī)制。方法 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）建立大鼠膿毒癥模型。健康成年雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組，每組24只。動(dòng)物模型制備成功后，于術(shù)后3、12、24h檢測(cè)肺組織勻漿標(biāo)本黃嘌呤氧化酶（XO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）含量。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。結(jié)果 術(shù)后3、12、24h假手術(shù)組XO分別為（2.4±0.3）U/g、（2.3±0.5）U/g、（2.4±0.4）U/g，MDA為（15.7±2.7）nmol/ mg、（15.2±2.9）nmol/mg、（15.6±2.6）nmol/mg，SOD為（58.8±8.0）U/mg、（58.1±10.1）U/mg、（58.7±9.5）U/ mg，GSH-Px為（33.2±5.4）U/mg、（32.5±7.0）U/mg、（33.1±6.3）U/mg；膿毒癥組XO分別為（4.2±0.6）U/ g、（5.5±0.7）U/g、（5.7±0.5）U/g，MDA為（29.3±5.7）nmol/mg、（36.3±6.6）nmol/mg、（41.4±7.3）nmol/mg，SOD為（43.3±7.0）U/mg、（41.8±6.9）U/mg、（38.2±7.4）U/mg，GSH-Px為（27.9±4.0）U/mg、（26.4±3.9）U/ mg、（24.3±3.3）U/mg。與假手術(shù)組比較，膿毒癥大鼠肺組織XO、MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 膿毒癥大鼠存在急性肺損傷，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激相關(guān)。

大鼠；膿毒癥；肺損傷；黃嘌呤氧化酶；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康成年雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量280～350g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 試 劑 黃嘌呤氧化酶（XO）試劑盒（美國(guó)RND公司，批號(hào)R3201L）；丙二醛（MDA）試劑盒（美國(guó)RND公司，批號(hào)R4785L）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（美國(guó)RND公司，批號(hào)R4421L）；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（美國(guó)RND公司，批號(hào)R7098L）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及模型制備 健康成年雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、膿毒癥組，每組24只。采用胡丹丹等[3]建立的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）法制備大鼠膿毒癥模型：大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，沿腹正中作一長(zhǎng)1.5cm的切口，打開(kāi)腹腔后小心分離盲腸，避免碰觸腸系膜血管，在盲腸根部結(jié)扎，在與腸系膜相對(duì)的盲端腸壁漿膜面用9號(hào)針頭穿刺2次，輕擠出少量?jī)?nèi)容物，還納盲腸于腹腔，關(guān)閉腹腔，逐層縫合，術(shù)后即刻予以皮下注射生理鹽水10mL/kg補(bǔ)充手術(shù)過(guò)程中丟失的體液。假手術(shù)組除不結(jié)扎和穿刺盲腸外，其余操作同膿毒癥組。

2.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè) 術(shù)后3、12、24h各組分別取8只大鼠，給予10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，處死。留取左肺固定于4%甲醛中石蠟包埋切片行HE染色，留取右肺置于-70℃冰箱，制作肺組織勻漿。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)肺組織勻漿標(biāo)本黃嘌呤氧化酶（XO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的含量。

2.3 肺組織病理觀察 肺組織用梯度酒精脫水、浸蠟和包埋，制成石蠟塊，用蘇木素染色，鹽酸酒精分化及自來(lái)水返藍(lán)，之后伊紅染色，再次脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠肺組織病理結(jié)果 假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，水腫和炎癥滲出少；隨著時(shí)間的推移，與假手術(shù)組比較，模型組肺組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸加重，肺水腫、出血以及肺不張逐漸加重，肺泡間隔逐漸增厚并破壞，見(jiàn)圖1（封二）。

3.2 大鼠肺組織XO、MDA、SOD、GSH-Px含量比較

與假手術(shù)組比較，膿毒癥大鼠肺組織XO、MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠肺組織XO、MDA、SOD、GSH-Px含量比較（±s）

表1 兩組大鼠肺組織XO、MDA、SOD、GSH-Px含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；XO：黃嘌呤氧化酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

假手術(shù)組膿毒癥組3h 12h 24h 3h 12h 24h 888888 2.4±0.3 2.3±0.5 2.4±0.4 4.2±0.6* 5.5±0.7* 5.7±0.5* 15.7±2.7 15.2±2.9 15.6±2.6 29.3±5.7* 36.3±6.6* 41.4±7.3* 58.8±8.0 58.1±10.1 58.7±9.5 43.3±7.0* 41.8±6.9* 38.2±7.4* 33.2±5.4 32.5±7.0 33.1±6.3 27.9±4.0* 26.4±3.9* 24.3±3.3*

4 討論

膿毒癥是臨床較為常見(jiàn)的一種危重癥，它除可引起劇烈的全身炎癥反應(yīng)外,還常導(dǎo)致肺、肝、腎、腸道、腦等多個(gè)器官的功能失常。尤其是膿毒癥導(dǎo)致的肺損傷發(fā)生早、病情重，常是患者死亡的直接原因[4]。肺臟是膿毒癥時(shí)最易受累的靶器官，表現(xiàn)為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征。過(guò)度的炎性因子釋放與氧化應(yīng)激，共同促進(jìn)急性肺損傷發(fā)生發(fā)展，目前其機(jī)制尚未完全明了，缺乏針對(duì)性的治療措施。因而研究膿毒癥導(dǎo)致肺損傷機(jī)制具有重要的意義[5]。

氧化應(yīng)激在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量自由基，可以和各種細(xì)胞成分發(fā)生不可逆反應(yīng)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。氧化應(yīng)激不但氧化蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)活性，導(dǎo)致蛋白酶釋放，使抗氧化劑和抗蛋白酶失活，而且可以直接損傷DNA導(dǎo)致斷裂和點(diǎn)突變；導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生血管活性物質(zhì)和前炎性物質(zhì)如血栓素；改變轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致前炎性物質(zhì)基因表達(dá)增強(qiáng)[6]。最終導(dǎo)致肺微血管完整性和肺泡屏障破壞，并且損傷Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，引起板層狀小體水腫、崩解，肺表面活性物質(zhì)減少、功能下降，從而導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)生[6]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是嘌呤核苷酸的分解代謝酶，對(duì)自由基的產(chǎn)生有重要作用，反映缺氧損傷的情況[7]。急性肺損傷時(shí)，組織缺血/缺氧，組織中的黃嘌呤脫氫酶可變構(gòu)為XO。機(jī)體內(nèi)XO活性增高，意味著機(jī)體內(nèi)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)的激活,氧自由基的生成增多。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是自由基與細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體膜等發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，它反映體內(nèi)氧自由基生成量及活性，間接地反映細(xì)胞受損的程度[8]。即機(jī)體內(nèi)氧自由基的活性越高，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)越強(qiáng)，則組織細(xì)胞的損傷越重。MDA含量的變化可代表體內(nèi)氧自由基的變化，進(jìn)而反應(yīng)肺內(nèi)氧化損傷程度。MDA含量增加表明CLP術(shù)后氧自由基產(chǎn)生增多，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肺泡細(xì)胞[9]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的抗氧化酶，其參與清除超氧陰離子、減少還原型亞硝酸鹽的形成及所致的損傷，對(duì)肺具有保護(hù)作用[10]。胞外SOD的表達(dá)活性水平與肺損傷的程度呈明顯負(fù)相關(guān)[11-12]，而氧化應(yīng)激產(chǎn)物可降低該酶活性[13]。本研究結(jié)果顯示，在CLP術(shù)后24h，膿毒癥組大鼠血清SOD活性水平顯著下降，即膿毒癥時(shí)機(jī)體存在抗氧化能力減弱的情況。谷胱甘肽過(guò)氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是氧自由基清除酶，是肺組織重要的抗氧化防御因子，它能夠清除呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量過(guò)氧化物和羥自由基，從而減輕細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除脂類自由基,保護(hù)機(jī)體免受攝入脂質(zhì)過(guò)氧化物的損害[14]，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害。CLP是比較公認(rèn)的臨床相關(guān)性較強(qiáng)膿毒癥大鼠模型常用的方法，本研究顯示，CLP能使大鼠體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)增加，導(dǎo)致膿毒癥大鼠急性肺損傷，其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

［1］Alastair G，Proudfoot，Danny F，et al.Human models of acute lung injury［J］.Dis Mod&Mechan，2011，4（2）：145-153.

［2］Wu L，Gokden N，Mayeux PR.Evidence of the role of reactive nitrogen species in polymicrobial sepsis-induced renal peritubular capillary dysfunction and tubular injury［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18（6）：1807-1815.

［3］胡丹丹，楊國(guó)良，陳偉.益氣涼血化疲湯對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷的影響［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22（11）：856-858.

［4］Huang Y，Pettitt SJ，Guo G，et al.Isolation of homozygous mutantmouse embryonic stem cells using a dual selection system［J］.Nucleic Acids Res，2012，40（3）：e21.

［5］田蜜，劉芳芳，紀(jì)木火，等.富氫液對(duì)大鼠膿毒血癥引起急性肺損傷的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12（32）：6225-6227.

［6］Hybertson BM，Lee YM，Cho HG，et a1.Alveolar type II cell abnormalities and peroxide formation in Lungs ofrats given IL-1 intratracheally［J］.Inflammation，2000，24（4）：289-303.

［7］Warzecha Z，Dembinski A，Ceranowicz P，et al.Ischemic preconditioning of the hindlimb or kidney does not attenuate the severity of acute ischemia/reperfusion-induced pancreatitis in rats［J］.J Physiol Pharmacol，2008，59（2）：337-352.

［8］Yang G，Han Y，Tian X，et al.Pattern of expression of the CREG gene and CREG protein in the mouse embryo［J］. Mol Biol Rep，2011，38（3）：2133-2140.

［9］馬春燕，陳麗.氯胺酮對(duì)膿毒癥大鼠肺組織HO-1表達(dá)的影響［J］.中國(guó)醫(yī)療前沿，2011，6（22）：15-16.

［10］Kinnula VL，Crapo JD.Superoxide dismutases in the lung and human lung diseases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2003，167（12）：1600-1619.

［11］Yen CC，Lai YW，Chen HL，et al.Aerosolized human extracellular superoxide dismutase prevents hyperoxiainduced lung injury［J］.PLoS One，2011，6（10）：26870.

［12］Hassett P，Curley GF，Contreras M，et al.Over expression of pulmonary extracellular superoxide dismutase attenuates endotoxin-induced acute lung injury［J］.Intensive Care Med，2011，37（10）：1680-1687.

［13］Ware LB.Pathophysiology of acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome［J］.Semin Respir Crit Care Med，2006，27（4）：337-349.

［14］Gemma FM，Paloma CS，Roberto E，et al.Antio xidant enzyme activity and coronary heart disease:meta-analyses of observational studies［J］.Am J Epidemiol，2009，170（2）：135-147.

（收稿：2015-06-15 修回：2015-07-28）

Mechanism of Acute Pulmonary Injury in Rats with Sepsis

HUANG Lisou,LOU Liming,WANG Shiqiang, HU Dandan,CHEN Suzhen,XU Yikai,ZHANG Qian Department of Respiratory Diseases,the Third Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To investigate the mechanism of acute pulmonary injury in sepsis rats.Methods Colon ligation perforation was applied to rats to establish sepsis model.Forty-eight healthy adult male SD rats were randomly divided into sham group and sepsis group（n=24 in each group）.At 3,12,24h after surgery,every 8 rats in each group were sacrificed to obtain lung tissue for determination of xanthine oxidase（XO）,malonaldehyde（MDA）, superoxide dismutase（SOD）,and glutathione peroxidase（GSH-Px）.Pathological changes of lung tissue was observed with light microscopy.Results At 3,12,24h after surgery in sham group,XO were 2.4±0.3U/g,2.3±0.5U/g,and 2.4±0.4U/g,MDA were 15.7±2.7nmol/mg,15.2±2.9nmol/mg,15.6±2.6nmol/mg,SOD were 58.8±8.0U/mg,58.1±10.1U/ mg,58.7±9.5U/mg,and GSH-Px were 33.2±5.4U/mg,32.5±7.0U/mg,33.1±6.3U/mg;in sepsis group,XO were 4.2± 0.6U/g,5.5±0.7U/g,and 5.7±0.5U/g,MDA were 29.3±5.7nmol/mg,36.3±6.6nmol/mg,41.4±7.3nmol/mg,SOD were 43.3±7.0U/mg,41.8±6.9U/mg,38.2±7.4U/mg,and GSH-Px were 27.9±4.0U/mg,26.4±3.9U/mg,24.3±3.3U/mg.Compared with sham group,the concentration of XO and MDA were significantly increased and SOD and GSH-Px were significantly decreased in sepsis group（P＜0.01）.Conclusion Sepsis rats suffer from acute pulmonary injury,which may be related to oxidative stress.

rats;sepsis;pulmonary injury;xanthine oxidase;malonaldehyde;superoxide dismutase;glutathione peroxidase膿毒癥是細(xì)菌感染后引起的全身炎癥反應(yīng)，是危重患者手術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥，同時(shí)也是臨床危重病患者死亡的重要原因之一。在眾多膿毒癥并發(fā)的器官損傷中，膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）發(fā)生早、病情重，也是加速患者死亡的重要原因[1]。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）是目前公認(rèn)的與臨床相關(guān)性較強(qiáng)的膿毒癥模型[2]，本研究采用CLP制備大鼠膿毒癥模型，觀察膿毒癥大鼠肺損傷的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010ZA047）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院院級(jí)醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No. ZS10ZA04）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科（杭州310005）

樓黎明，Tel：13505712348；E-mail：llm2348@hotmail.com