葉丹怡　朱敏

摘要：目的：建立HPLC/MS方法，快速定性定量檢測(cè)保健食品中非法添加的硝苯地平。方法：采用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀。色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm）色譜柱。柱溫：30OC。流動(dòng)相：乙腈：0.2%甲酸水溶液=71：29。流速為0.6mL/min。質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。以保留時(shí)間及定性離子對(duì)之間的相對(duì)豐度定性。以定量離子對(duì)峰面積定量。結(jié)果：硝苯地平在1.083～108.3ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r>0.9998）。平均加樣回收率：99.44%。定量限為216.6pg 結(jié)論：本方法定性可靠、定量準(zhǔn)確，且快速簡(jiǎn)便。可用于保健食品中非法添加硝苯地平的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：硝苯地平 非法添加 定性 定量 HPLC/MS

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）02-0011-02

硝苯地平是第一代鈣拮抗劑，為抗高血壓、防治心絞痛藥物，適用于各種類型的高血壓，對(duì)頑固性、重度高血壓也有較好療效，是20世紀(jì)80年代中期世界暢銷的藥物之一。該藥的特點(diǎn)是：起效快，峰/谷比值高，導(dǎo)致了神經(jīng)體液活化，經(jīng)多年臨床使用，該藥的療效得到了肯定。硝苯地平在價(jià)格上也占據(jù)了強(qiáng)有力的優(yōu)勢(shì)。但藥效時(shí)間短，血壓波動(dòng)大，尚有負(fù)性肌力和負(fù)性傳導(dǎo)作用，增加冠心病患者的死亡率[1]。一些不法商販，在一些宣稱具有降壓療效的保健食品中非法添加使用，由于非法添加的化學(xué)藥物，劑量上無(wú)從把握，有些患者在不知情的情況下使用，無(wú)意中增加了風(fēng)險(xiǎn)性，造成不良反應(yīng)，嚴(yán)重的更是威脅自己的生命[2]，所以，急需對(duì)此類非法添加行為建立檢驗(yàn)檢測(cè)方法，嚴(yán)厲打擊。之前已有不少研究者用不同的一起監(jiān)測(cè)中成藥制劑中添加降壓藥物此保健品已報(bào)道的只有樊磊磊等的定量檢測(cè)非法添加物利血平，因懷疑其中不止混有利血平，還有其他降壓化學(xué)藥品，本文采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，檢測(cè)出其還混有硝苯地平，并進(jìn)行首次定性定量同步檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 6460 安捷倫公司）；色譜柱Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） （安捷倫公司）；濾膜0.8μm（上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠）；SK5210HO超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；BT124S電子分析天平（北京賽多利斯公司）；BP211D電子分析天平（北京賽多利斯公司）。硝苯地平對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)：100338-200502中國(guó)藥品生物制品檢定所），清腦保心康膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20002158 藥品安全專項(xiàng)整治行動(dòng)送檢樣品）；乙腈；甲醇均為色譜純（Merck公司），水為超純水。

1.2 HPLC/MS條件

HPLC條件：色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） ，柱溫：30OC，進(jìn)樣量：2μl，乙腈：0.2%甲酸水溶液=71：29；流速：0.6mL/min。MS條件：ESI源（+），毛細(xì)管電壓：3.5kV，離子源溫度：100，干燥氣溫度：350 OC，干燥氣流速：10L/min，霧化器壓力：50psi。監(jiān)測(cè)方式：MRM，監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

避光條件下， 精密稱取硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品10.83mg，置棕色容量瓶中，加甲醇定量稀釋制成濃度為10.83ug/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，2～8℃冷藏保存，備用。

1.4 供試品溶液的制備

避光條件下，取樣品內(nèi)容物適量，混勻后，取一次性服用量樣品（4粒，約1g），精密稱定后，置50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超聲處理15min，冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，稀釋2000倍后，過(guò)0.8μm微孔濾膜，即得[3]。

1.5 空白溶液制備

直接取稀釋溶劑即得。

2 結(jié)果

2.1 定性分析

取標(biāo)準(zhǔn)貯備液，稀釋制成216.6ng/ml的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣2μl，記錄所得質(zhì)譜MRM色譜圖。統(tǒng)計(jì)并分析對(duì)照品溶液所得圖譜中硝苯地平的色譜保留時(shí)間（RT=2.6min）及定性離子碎片存在有（m/z：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1）。見圖1。

取供試品溶液，進(jìn)樣2μl，記錄所得質(zhì)譜MRM色譜圖。統(tǒng)計(jì)并分析供試品溶液蘇哦的圖譜，如檢測(cè)硝苯地平的質(zhì)譜MRM離子通道中有色譜峰出現(xiàn)，先與對(duì)照品中峰的保留時(shí)間對(duì)比（供試品峰RT=2.6min的±2.5%允許誤差范圍內(nèi)），此一致，再對(duì)比定性離子碎片是否跟對(duì)照品一致，也一致，如判斷供試品溶液中含有此化學(xué)藥品。見圖2。

2.2 定量分析

對(duì)判定供試品溶液中含有硝苯地平的供試品，則按其定量離子對(duì)（m/z）：347.1>315.1的峰面積進(jìn)行含量計(jì)算。含量測(cè)定方法研究如下：

（1）線性考察和定量限配制系列濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明硝苯地平在1.083～108.3ng/ml范圍內(nèi)線性方程為Y=43.673782X-2.777850（r=0.9999），呈良好的線性關(guān)系，進(jìn)樣量為2μl，硝苯地平的定量限為216.6pg。

（2）精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液1份，連續(xù)進(jìn)樣6次，硝苯地平定量離子對(duì)峰面積的RSD為1.68%。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)取此陽(yáng)性樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，依次進(jìn)樣測(cè)定。硝苯地平含量的RSD為：1.26%。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)取2.2.3重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下所制備的同一供試品溶液，分別在2、4、8、16h，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果硝苯地平的峰面積RSD為1.18%，表明供試品溶液在制備后的16h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（5）回收率試驗(yàn)取一次性服用量的陽(yáng)性樣品6份，分別置于50ml容量瓶中，各精密加入10.83ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液甲醇2.5ml，超聲處理15min，冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，稀釋2000倍后，過(guò)0.8μm微孔濾膜，進(jìn)行測(cè)定。平均回收率為：99.44%，RSD為：0.94%。見表1。

（6） 樣品測(cè)定取供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以所監(jiān)測(cè)的MRM色譜圖中定量離子對(duì)（m/z）：347.1>315.1的峰面積計(jì)算，樣品中含硝苯地平：5.1mg/g。

2.3 討論

在試驗(yàn)中選擇流動(dòng)相時(shí)，曾比較過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀常用到的乙腈-水溶液、乙腈-0.2%甲酸的水溶液，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.2%甲酸的水溶液作為流動(dòng)相，所得的硝苯地平的離子信號(hào)明顯增強(qiáng)，這與其結(jié)構(gòu)中所含的帶N的堿性基團(tuán)，在酸性條件下有利于其離子化有關(guān)。

3 結(jié)語(yǔ)

清腦保心康膠囊以具有降壓功效的純中藥制劑保健食品的形式，非法添加化學(xué)藥品硝苯地平銷售，其成分復(fù)雜，干擾因素較多，采用其他檢測(cè)方法難度頗大，但采用串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜MRM監(jiān)測(cè)方式，選擇性好，并能有效排除其他干擾，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，避免了因前處理可能帶來(lái)的誤差，采用相對(duì)保留時(shí)間及離子碎片進(jìn)行定性，定性結(jié)果更為準(zhǔn)確，且靈敏度也極高。采用HPLC分析樣品，在3min內(nèi)即可完成樣品的檢測(cè)，兩者結(jié)合輕易實(shí)現(xiàn)了快速的定性定量監(jiān)測(cè)，故此，HPLC/MS法明顯優(yōu)于簡(jiǎn)單的HPLC法[4]。

參考文獻(xiàn)

[1]王玲.高血壓病降壓藥物的合理應(yīng)用[J]廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，17（1）：55-56.

[2]周蘭坤.談降壓藥物的不良反應(yīng)[J]中外醫(yī)療，2009，29（15）：90.

[3]劉吉金.降壓保健品及中成藥中非法添加化學(xué)成分的快速檢測(cè)方法研究[J]中成藥，2008，30（1）：144.

[4]劉吉金，楊敏，李軍等.HPLC同時(shí)檢測(cè)保健品及中成藥中非法添加9種抗高血壓化學(xué)藥物的研究[J]中國(guó)現(xiàn)在應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25（8）：717.