曾建偉　陳星強(qiáng)　陳春蓉　吳廣文　莊志強(qiáng)　林如輝　尤玉瑩　鄭春松

【摘 要】目的：從Wnt/β-catenin信號通路觀察透骨消痛膠囊對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。方法：60只健康清潔級2月齡雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組和透骨消痛膠囊組，每組20只。模型對照組和透骨消痛膠囊組采用質(zhì)4%木瓜蛋白酶雙膝關(guān)節(jié)腔注射，成功復(fù)制骨關(guān)節(jié)炎模型后，透骨消痛膠囊組給予透骨消痛膠囊287.5 mg·kg-1，正常對照組和模型對照組給予相同劑量的生理鹽水。給藥2個月后，采用Western blot法觀察各組關(guān)節(jié)軟骨中含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5（ADAMTS-5）、Wnt-4、β-catenin和基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）的表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組ADAMTS-5、Wnt 4、β-catenin和MMP-13表達(dá)升高（P < 0.05）；與模型對照組比較，透骨消痛膠囊組ADAMTS-5、Wnt 4、β-catenin和MMP-13表達(dá)降低（P < 0.05）。結(jié)論：透骨消痛膠囊對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用與其降低Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；透骨消痛膠囊；Wnt/β-catenin信號通路；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.12.001

【ABSTRACT】 Objective：To investigate the protective effect of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）

on knee articular cartilage of rats from Wnt/β-catenin signaling pathway.Methods：Sixty healthy two-month male SD rats were randomly divided into a normal control group，a model control group and a Tougu Xiaotong Jiaonang group （TXJ group），20 rats in each.The model control group and the TXJ group were given double knee joint cavity injection with 4% papain.After the osteoarthritis models were successfully established，the TXJ group was given Tougu Xiaotong Jiaonang 287.5 mg·kg-1，while the normal control group and the model control group were given the same dose of physiological saline.After 2 months of administration，the Western blot method was used to observe the expressions of ADAMTS-5，Wnt-4，

β-catenin and MMP-13 in articular cartilage of three groups.Results：Compared with the normal control group，the expressions of ADAMTS-5，Wnt-4，β-catenin and MMP-13 in the model control group increased

（P < 0.05），while compared with the model group，the expressions of ADAMTS-5，Wnt-4，β-catenin and MMP-13

in the TXJ group decreased（P < 0.05）.Conclusion：The protective effect of Tougu Xiaotong Jiaonang on articular cartilage is correlated with the reduction of the Wnt/β-catenin signaling pathway expression.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；

Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛膠囊）；

Wnt/β-catenin signaling pathway；experiment in vivo；rats

透骨消痛膠囊由巴戟天、白芍、川芎和腫節(jié)風(fēng)組成，具有補(bǔ)腎柔肝和活血祛風(fēng)的功效[1]，臨床上用于治療早、中期膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）[2]。前期研究顯示，透骨消痛膠囊能緩解4%木瓜蛋白酶所致大鼠軟骨組織超微結(jié)構(gòu)的異常變化，改善軟骨下骨膠原纖維和鈣磷結(jié)晶的排列，抑制潮線復(fù)制和軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原的降解，上調(diào)軟骨生長因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）表達(dá)，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變[3-4]；

并可以上調(diào)LC3 I/II、ULK1和Beclin1蛋白的表達(dá)水平，提高細(xì)胞自噬的活性，保護(hù)軟骨細(xì)胞等[5]；

而Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[6]，其顆粒劑的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了對此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有調(diào)控作用，但其相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)未見報(bào)道[7]。因此，本研究觀察大鼠KOA的關(guān)節(jié)軟骨中Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，探討透骨消痛膠囊對其的調(diào)控作用，進(jìn)一步闡明其保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)制，現(xiàn)總結(jié)

如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康清潔級2月齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCKK（滬）2012-0002。福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供清潔級實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施（合格證號：醫(yī)動學(xué)第23-016號）。實(shí)驗(yàn)動物的處置按照2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 透骨消痛膠囊為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑，臨床用量為每粒460 mg，每次3粒，每日2次。批準(zhǔn)文號：閩制字Z20100006。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 木瓜蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司）；RIPA裂解液（強(qiáng)）、PMSF（100 mM）、

SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、20×TBS、Western封閉液、SDS-PAGE電泳緩沖液、Western 一抗稀釋液、Western 二抗稀釋液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物有限公司）；Anti-WNT4、Anti-MMP13、Goat Anti-Rabbit IgG H&L （HRP）、Goat F（ab'）2 Anti-Mouse IgM mu chain （HRP）、Anti-ADAMST-5（美國abcam公司）；Anti-beta Actin、Anti-beta Catenin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（新型快速）、電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio Rad公司）等。

2 方 法

2.1 動物分組及模型建立 將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組和透骨消痛膠囊組，每組20只。模型對照組和透骨消痛膠囊組從實(shí)驗(yàn)開始的第1，4，7天分別采用4%木瓜蛋白酶雙膝關(guān)節(jié)腔注射[8]，建立KOA大鼠模型。

2.2 給藥方法 造模2周后，切取脛骨平臺，利用HE染色法[9]，觀察正常對照組、模型對照組和透骨消痛膠囊組的軟骨組織形態(tài)，進(jìn)行模型鑒定。模型制備成功后，參照藥理試驗(yàn)中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[10]，透骨消痛膠囊組每日給予透骨消痛膠囊287.5 mg·kg-1，正常對照組、模型對照組則給予同劑量的生理鹽水灌胃。

2.3 檢測指標(biāo)及方法 分別給予生理鹽水和透骨消痛膠囊灌服2個月，刮取各組軟骨組織，剪碎后經(jīng)勻漿器充分研磨，用裂解液裂解提取蛋白，經(jīng)BCA測定濃度。加入5×loading buffer，100 ℃ 5 min

變性。各組每孔按50 μg上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，半干濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，均在室溫用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加入β-Actin（1∶1000）、MMP-13（1∶3000）、β-catenin（1∶500）、Wnt-4（1∶500）和ADAMST-5（1∶1000）一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入對應(yīng)的二抗（1∶3000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加ECL發(fā)光劑，凝膠成像系統(tǒng)掃描，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白β-Actin條帶灰度值

的比值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 研究中軟骨組織的蛋白提取、含量檢測均經(jīng)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采用 SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 造模情況 造模2周后，正常對照組軟骨表面光滑，四層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨分布均勻，潮線完整；模型對照組軟骨表面凹凸不平，表層和深層軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分軟骨細(xì)胞固縮，偏于一側(cè)，有明顯的炎性細(xì)胞滲出。病變符合骨關(guān)節(jié)炎的基本變化。見圖1。

3.2 關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTS-5、Wnt-4、β-catenin和

MMP-13的含量 給藥2個月后，與正常對照組比較，模型對照組ADAMTS-5、Wnt-4、β-catenin和MMP-13表達(dá)升高（P < 0.05）；與模型對照組比較，透骨消痛膠囊組ADAMTS-5、Wnt-4、β-catenin和MMP-13表達(dá)降低（P < 0.05）。見圖2、圖3。

4 討 論

KOA是一種以關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病變的疾病。有研究表明，木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，能分解軟骨基質(zhì)的蛋白多糖；蛋白多糖的丟失可減弱軟骨基質(zhì)對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞退變以致破壞、軟骨降解，即其在維持軟骨的硬度和彈性方面具有重要作用，已經(jīng)成為判斷軟骨退變的指標(biāo)之一[11-12]。而以ADAMTS-4和ADAMTS-5為主的蛋白聚糖酶均能降解蛋白多糖，且去除ADAMTS-5活性能對抗蛋白多糖的分解，但是，去除ADAMTS-4活性無此作用[13]。因此，本研究以關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶復(fù)制大鼠KOA模型，檢測給藥2個月后各組軟骨中ADAMTS-5的含量，反映軟骨退變程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，透骨消痛膠囊能降低KOA關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTS-5的含量，提示其減少蛋白多糖的降解，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷。

為了進(jìn)一步研究透骨消痛膠囊對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，筆者研究了其對軟骨細(xì)胞生長、分化和成熟相關(guān)的Wnt/β-catenin信號通路影響[14]。前期研究表明，在Wnt/β-catenin信號通路中，Wnt-4過度表達(dá)引起β-catenin持續(xù)表達(dá)，導(dǎo)致生長板軟骨細(xì)胞肥大和向終端分化。而且，在OA損傷軟骨和退變的軟骨細(xì)胞中，β-catenin表達(dá)增多，會刺激MMPs的分泌[15]。其中，MMP-13可直接降解軟骨基質(zhì)中最具特征的Ⅱ型膠原，在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中起到重要作用，可作為軟骨破壞性的標(biāo)志性分

子[16]。而且，它也是Wnt/β-catenin（下轉(zhuǎn)第31頁）

（上接第7頁）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游分子[14，17]。本研究檢測給藥2個月后各組軟骨中Wnt-4、β-catenin和MMP-13的含量，結(jié)果顯示，透骨消痛膠囊能降低軟骨中Wnt-4、β-catenin和MMP-13的表達(dá)，提示透骨消痛膠囊保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨與Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

本研究以透骨消痛膠囊為干預(yù)藥物，以大鼠KOA為模型，以軟骨保護(hù)為主線，在研究反映軟骨退變程度指標(biāo)ADAMTS-5的基礎(chǔ)上，旨在研究透骨消痛膠囊保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)制，證實(shí)了透骨消痛膠囊能降低ADAMTS-5的含量，減少蛋白多糖的降解，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，其作用機(jī)制之一為透骨消痛膠囊對Wnt/β-catenin信號通路的多靶點(diǎn)調(diào)控作用。

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收稿日期：2015-07-29；修回日期：2015-10-21