馬武開(kāi) 陸道敏 姚血明 黃穎 唐芳 周靜

【摘 要】目的：觀察核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的表達(dá)，探討其與炎癥的關(guān)系。方法：將24只6周齡雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型對(duì)照組，每組12只。模型對(duì)照組建立CIA大鼠模型，采用足趾容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎癥，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-17，免疫印跡法檢測(cè)滑膜細(xì)胞NF-κB/P65、NF-κB/P50和IκBα的表達(dá)。結(jié)果：CIA模型大鼠足趾容積大于空白對(duì)照組，模型對(duì)照組大鼠于造模后第14天開(kāi)始，關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分逐漸增加，第28天左右達(dá)到高峰。模型對(duì)照組大鼠IL-17表達(dá)高于空白對(duì)照組（P < 0.01），

NF-κB/P65、NF-κB/P50和IκBα蛋白活性明顯高于空白對(duì)照組（P < 0.05或P < 0.01）。結(jié)論：CIA模型大鼠滑膜細(xì)胞NF-κB活性蛋白增高，IL-17呈高表達(dá)，可能與炎癥相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；滑膜細(xì)胞；血清；NF-κB；IL-17；大鼠

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種原因不明的自身免疫性疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，

NF-κB）是一種廣泛存在于真核細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐，在腫瘤、哮喘及RA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-3]。NF-κB參與炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期控制與分化，并在RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）是一種促炎癥細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)活化T細(xì)胞和刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)，抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，最終導(dǎo)致骨侵蝕，IL-17與其他細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等相互

作用，導(dǎo)致RA病變進(jìn)展[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，

CIA）大鼠模型，觀察CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞NF-κB蛋白活性及血清IL-17的水平，探討NF-κB、

IL-17與CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雌性Wistar大鼠24只，

6周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（渝）20070006]，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。

1.2 主要試劑 牛Ⅱ型膠原（美國(guó)Sigma公司，C7806）；不完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)5881）；兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗體（美國(guó)millipore公司，NG1861049）；兔抗大鼠NF-KB（p105/p50）單克隆抗體（美國(guó)Epitomics公司）；兔抗大鼠IκBα單克隆抗體（美國(guó)Epitomics公司）；IL-17 ELISA試劑盒（美國(guó)ADL公司，RT110371）。

1.3 主要儀器 LD25-2自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；YLS-7B大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，校零誤差≤±5 μL）；

高速分散均質(zhì)勻漿機(jī)（A200-12G）；臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL-16M型）；低溫冰箱（型號(hào)-86-

120WA），電泳儀（DYY-7C型）；紫外分光光度計(jì)（日本島津）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)GE Healthcare公司）；電泳儀（江蘇常州無(wú)線電元件四廠）；LY70倒置顯微鏡（日本Olypmpus公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（上海同舸工貿(mào)有限公司，DG5033A）；洗板機(jī)（130011，AT-828）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組 將24只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型對(duì)照組，每組12只，模型對(duì)照組大鼠按照文獻(xiàn)[5]建立CIA模型。將牛Ⅱ型膠原10 mg溶于5 mL成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 mol·L-1

的醋酸溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg·mL-1的膠原溶液，使之充分混勻，置于4 ℃冰箱過(guò)夜。再與等體積弗氏完全佐劑在冰浴中充分乳化，配制成1 mg·mL-1的膠原乳劑。于大鼠尾根部皮下多點(diǎn)注射膠原乳劑0.5 mL，第7天再同法予膠原乳劑0.3 mL加強(qiáng)免疫。空白對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不做任何處理。兩組大鼠自由攝食、飲水，溫度控制在18～22 ℃，濕度控制在65%～80%。

2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI） 致炎第7天按AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎程度，無(wú)關(guān)節(jié)紅腫記0分，趾關(guān)節(jié)紅腫記1分，趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹記2分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹記3分，踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹記4分。每個(gè)關(guān)節(jié)最高分為4分，4個(gè)關(guān)節(jié)累計(jì)積分即為每只大鼠的AI。分別計(jì)算各組大鼠造模前及造模后7，14，21，28 d時(shí)的AI。28 d后斷頭處死大鼠取血，離心取上清，剝離雙側(cè)后膝關(guān)節(jié)滑膜用于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 足趾容積 造模第1天用大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量每組大鼠前后足趾容積，分別于第14，21，28天測(cè)量足趾容積，并做好記錄。

2.4 關(guān)節(jié)滑膜病理切片 取雙側(cè)后膝關(guān)節(jié)滑膜及軟骨，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛液固定，常規(guī)脫鈣、脫水，石蠟包埋，切片后HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜及周?chē)M織的病理變化。

2.5 血清IL-17檢測(cè) 采用ELISA法，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，先加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，設(shè)置陰性對(duì)照；37 ℃ 反應(yīng)30 min溫育，后洗板5次；加入酶標(biāo)試劑，37 ℃ 反應(yīng)，洗板5次；加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min，加入終止液，上酶標(biāo)檢測(cè)OD值（吸光度），重復(fù)3次，取平均值。

2.6 NF-κB檢測(cè) 采用Western blot法，將關(guān)節(jié)滑膜組織低溫勻漿后加蛋白裂解液，置冰上40 min，于4 ℃置12 000 r·min-1離心機(jī)離心10 min，取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford 法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h；一抗4 ℃過(guò)夜。用不含抗體TBS-T液孵育作為陰性對(duì)照。反復(fù)洗膜后，將膜與堿性磷酸酶（AP） 標(biāo)記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h；洗膜后，用Western blot印跡觀察，用圖像分析測(cè)定各帶吸光度（A）值作定量分析。NF-κB檢測(cè)過(guò)程中，勻漿液中需加蛋白保護(hù)劑。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 兩組一般情況 實(shí)驗(yàn)中，12只模型大鼠造模成功10只。模型對(duì)照組大鼠于免疫后第14天左右開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)紅腫；隨著免疫時(shí)間進(jìn)

展，模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度逐漸加重，運(yùn)動(dòng)量明顯減少，出現(xiàn)直立困難，活動(dòng)障礙，毛發(fā)晦暗無(wú)澤，食欲減少，體質(zhì)量減輕，至第28天關(guān)節(jié)腫脹程度達(dá)到高峰。見(jiàn)圖1。

3.2 兩組血清IL-17比較 ELISA結(jié)果顯示，空白對(duì)照組IL-17為（19.54±5.76）ng·mL-1，模型對(duì)照組為（36.71±9.12）ng·mL-1，模型對(duì)照組大鼠血清IL-17表達(dá)高于空白對(duì)照組（P < 0.01）。

3.3 兩組大鼠關(guān)節(jié)滑膜NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值比較 免疫蛋白印跡結(jié)果分析顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值明顯升高

（P < 0.05或P < 0.01）。說(shuō)明模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的蛋白活性呈高表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠關(guān)節(jié)滑膜NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值比較 組別 動(dòng)物數(shù)

（只） NF-κB/P65 NF-κB/P50 IκBα

空白對(duì)照組 12 3.42±1.75 3.43±1.52 4.83±1.20

模型對(duì)照組 10 6.45±2.671） 6.37±1.892） 6.70±2.252）

注 與空白對(duì)照組比較，1）P < 0.05，2）P < 0.01

3.4 兩組AI評(píng)分結(jié)果比較 模型對(duì)照組大鼠致炎后2周開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)紅腫，4周后腫脹達(dá)高峰，部分關(guān)節(jié)變形。見(jiàn)表2。

3.5 兩組各時(shí)間點(diǎn)足趾關(guān)節(jié)容積變化比較 隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，模型對(duì)照組大鼠足趾關(guān)節(jié)腫脹逐漸加重，足趾容積增加。見(jiàn)表3。

3.6 兩組關(guān)節(jié)滑膜形態(tài)學(xué)變化比較 病理染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜未見(jiàn)明顯的血管擴(kuò)張、增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組滑膜組織可見(jiàn)血管增生、滑膜增厚、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，軟組織增生。見(jiàn)圖2。

4 討 論

RA是一種多細(xì)胞因子參與的侵蝕性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，NF-κB信號(hào)通路在細(xì)胞因子的激活過(guò)程中起著“開(kāi)關(guān)”作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB多以異源二聚體存在，并與抑制物IκB結(jié)合成三聚體以無(wú)活性方式存在于細(xì)胞質(zhì)中。NF-κB的活化與調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程。生理狀態(tài)下NF-κB活化受到機(jī)體內(nèi)在機(jī)制調(diào)控，參與多種生命過(guò)程。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見(jiàn)的是NF-κB p65與p50結(jié)合形成p65/p50二聚體，在靜息狀態(tài)下，胞漿中NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合體，覆蓋NF-κB核定位信號(hào)，使NF-κB錨定于胞質(zhì)中，不能發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。IκB亞基IκBα與NF-κB二聚體上的兩個(gè)核定位序列中的一個(gè)結(jié)合，使非活性狀態(tài)的NF-κB-IκBα進(jìn)入細(xì)胞核。同時(shí)，IκBα蛋白氨基末端的出核信號(hào)（nuclear-export

signal，NES）使NF-κB-IκBα復(fù)合物移出胞核，NF-κB-IκBα復(fù)合物在核內(nèi)與核外處于動(dòng)態(tài)平衡中[7]。IκBα啟動(dòng)子上有一個(gè)NF-κB反應(yīng)元件，對(duì)刺激比較敏感，能夠快速被降解與再合成[8]；當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等外源性刺激，IκB被降解，NF-κB異二聚體移位到胞核內(nèi)，與DNA上的κB基序列相結(jié)合從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。NF-κB參與炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期控制與分化，并在RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用。RA滑膜細(xì)胞中TNF-α和IL-1β等通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活I(lǐng)KK激酶復(fù)合體。IκB在IKK激酶復(fù)合體作用下被降解，釋放NF-κB，從而調(diào)控各種炎癥介質(zhì)基因（如TNF-α與IL-1β）的表達(dá)。炎癥因子與活化的NF-κB形成正相調(diào)控循環(huán)，兩者構(gòu)成的正反饋機(jī)制使RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞得以維持與進(jìn)展[9-10]。研究表明，NF-κB在CIA大鼠滑膜組織中表達(dá)升高，且主要于細(xì)胞核中表達(dá)[11]。NF-κB的調(diào)控與活化在RA的病理變化中占有重要地位。本研究結(jié)果表明，NF-κB的活性在CIA大鼠關(guān)節(jié)致炎后明顯增高，表明NF-κB參與CIA炎癥的調(diào)控。

IL-17是一種前炎性促炎癥細(xì)胞因子，主要由Thl7細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的募集和激活嗜中性粒細(xì)胞能力，能誘導(dǎo)活化T細(xì)胞和刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)IL-1、IL-6、TNF-α、一氧化氮合酶2、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子等多種細(xì)胞因子，抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，最終導(dǎo)致骨侵蝕。IL-17主要通過(guò)其受體（IL-17R）特異性結(jié)合，發(fā)揮促炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等多種功能。在RA的發(fā)病過(guò)程中，IL-17與其他細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α等相互作用，導(dǎo)致RA病變進(jìn)展[4]。本研究結(jié)果顯示，CIA模型大鼠血清IL-17明顯高于空白對(duì)照組，NF-κB的活性在CIA大鼠關(guān)節(jié)致炎后明顯增高，其血清IL-17的表達(dá)升高，說(shuō)明兩者可能在RA的發(fā)生、發(fā)展中相互作用、相互調(diào)節(jié)，IκBα亦呈升高趨勢(shì)。研究結(jié)果的可靠性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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收稿日期：2014-09-07；修回日期：2014-12-26