王志忠 漆曉華

摘 要：文章介紹了幾種主流豬源性成分的檢測方法，同時對各種方法的基本原理、適用范圍及優(yōu)缺點進行了探討。希望對相關(guān)工作提供參考。

關(guān)鍵詞：豬源性；檢測方法；擴增；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

食品安全問題是一個永恒的話題，而清真食品安全也成為各穆斯林民族的關(guān)注點，其中肉類食品中豬源性成分的檢測已提到一個重要的地位上來。目前，在動物源性成分的檢測方法中，最主要的是基于蛋白質(zhì)和基因的兩大類檢測方法，利用DNA的分子生物學(xué)方法開發(fā)定性、定量檢測食品、飼料中動物源性成分的方法和技術(shù)已逐漸成為該領(lǐng)域的研究主流，也成為多數(shù)國家檢測方法標準中指定的檢測方法[1]。包括傳統(tǒng)擴增（PCR）法，國家標準[2]就采用該法檢測飼料中的豬源性成分，而實時熒光定量擴增（PCR）法和雙重?zé)晒鈹U增法是在傳統(tǒng)實時PCR法基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，具有快速、高靈敏等優(yōu)點。同時，亦有采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法進行檢測的研究，幾種方法各有優(yōu)缺點。下面，文章對常用的傳統(tǒng)PCR法、實時熒光定量擴增（PCR）法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法進行分析探討，供食品檢驗人員借鑒。

1 傳統(tǒng)PCR法

傳統(tǒng)PCR法的基本原理，是對高溫下將雙鏈DNA變成單鏈的模板DNA的兩條鏈的一段互補序列，在適宜溫度下與兩條互不相補的寡核苷酸片段（引物）發(fā)生退火，利用DNA聚合酶催化延伸，如此反復(fù)擴增。然后利用凝膠電泳染色檢測，與已知陽性、已知陰性及空白組進行對照，如果檢測結(jié)果為陽性，再進行內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，并將反應(yīng)結(jié)果再次進行對照。酶切反應(yīng)亦為陽性，則判定含有豬源性成分。

傳統(tǒng)PCR方法的靈敏性和特異性較高，目前是鑒別豬源性成分的主要選擇。但在檢測中局限性較大，由于假陽性率高，最終定性需要進行酶切反應(yīng)造成檢測時間較長，而通過條帶亮度進行定量準確性相對較差，特別是在較大濃度它種動物肉存在下會明顯影響其靈敏度，不適用于摻入豬源性成分的肉類食品的檢測。

2 實時熒光定量擴增（PCR）法

實時熒光定量擴增法是美國Applied Bio systems公司基于傳統(tǒng)PCR法于1996年所提出，原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，其中包括熒光染色和熒光探針兩種辦法（目前以熒光探針技術(shù)為主，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性切斷探針，產(chǎn)生熒光信號），利用每次擴增循環(huán)的熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，在整個PCR反應(yīng)過程中，熒光定量PCR儀對反應(yīng)體系中熒光信號的變化量進行連續(xù)檢測，記錄其增加到某一閾值時所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)即循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct值），最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[3]。由于在PCR擴增時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在有線性關(guān)系，所以可以成為定量的依據(jù)。簡單地說，其擴增程序與傳統(tǒng)PCR法基本一致，但采用了在擴增過程中添加熒光劑的手段，并在每次擴增循環(huán)后收集熒光做出擴增曲線，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定其結(jié)果。

實時熒光定量擴增法的優(yōu)點是，縮短了檢測時間，克服了PCR固有的平臺效應(yīng)，從而可以較為準確進行定量，同時在較大濃度它種動物肉存在下不會明顯影響其靈敏度。但熒光探針法存在只適合特定目標、本底較低的探針難以找到等問題，特別是檢測成本昂貴，難以大范圍應(yīng)用。

3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法的原理是，在一定條件下提取的不同肉類肌漿蛋白會存在含量和種類差異，利用此差異，篩選出用離子強度為0M的純水提取肉中的肌漿蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒別豬肉特有的條帶，從而區(qū)分豬肉和其它肉類。同理，該方法亦可區(qū)分鑒別其它肉類。

Orhan等人于2011年[4]利用肌漿蛋白亞基數(shù)和分子質(zhì)量存在差異區(qū)別了生活在不同流域的遠東紅點鮭魚；Magdalena[5]、Hugo A[6]等也利用了肌漿蛋白的亞基條帶和分子量的差異對牛、馬、豬、羊等動物物種進行了區(qū)分。

該方法的優(yōu)點是，基于肌漿蛋白的差異性鑒定動物源性成分，較基于DNA序列特異性的PCR法成本較低，對儀器和操作要求也比較低，但在靈敏度、準確度和檢測限等方面不及PCR法，特別是無法對豬源性成分進行定量，應(yīng)用受到限制。

4 結(jié)束語

從上文看出，PCR和實時PCR法是目前豬源性成分檢測的主流方法，其定性準確，并可以對被檢成分進行定量，但對儀器設(shè)備要求較高，擴增耗時較長，難以進行快速檢測，同時檢測成本較高，特別是實時PCR法的成本昂貴。SDS-PAGE法檢測成本較低，且耗時較少，適用于現(xiàn)場快速檢測方法的開發(fā)，但靈敏度和準確度方面需進一步提高。

最后，需要說明的是，以上方法鑒別豬源性成分僅限于含有生鮮肉的制品，對于加工煮熟的肉制品則難以鑒定，尚需研究更新更好的檢測方法。

參考文獻

[1]李家鵬，喬曉玲，等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術(shù)研究進展[J].食品科學(xué)，2011，32（9）：340-346.

[2]GB/T 21101-2007.動物源性飼料中豬源性成分定性檢測方法[S].PCR方法.

[3]Heid CA，Stevens J，Livak K J，etal.Real time quantitative PCR [J].Genome Research，1996，6：986-994.

[4]Orhan Demir，Ali Günlü，F(xiàn)ahrettin Kücük，et al. Analysis of sarcoplasmic proteins in natural populations of mountain trout with SDS-PAGE[J].African Journal of Biotechnology，2011，10（55）：11758-11763.

[5]Magdalena Montowska，Edward Pospiech. Species identification of meat by electrophoretic methods[J].Acta Sci.Pol.，Technol.Aliment，2007，6（1）：5-16.

[6]Hugo A，Caldironi，Nicolas G. Quantitative determination of low-salt soluble protein patterns of bovine muscles cooked at different temperatures，by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J].Jourmal of Food Science，1980（45）：901-904.