趙增成 傅劍 李穎 林樹(shù)乾 李桂明 黃中利 馮敏燕 宋敏訓(xùn)

摘 ?要：為了篩選出有效的防治新城疫的中草藥，采用雞胚接種試驗(yàn)，對(duì)虎杖煎煮液的體外抗新城疫病毒活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明：中藥虎杖在體外對(duì)新城疫病毒具有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：虎杖;新城疫病毒;雞胚試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S858.313.76 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）04-0013-04

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種禽類的高度接觸性、傳染性、致死性疾病，是嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。盡管世界各國(guó)對(duì)ND都采取了嚴(yán)密的防控措施，但它依舊是危害禽類的主要傳染病[1，2]。中藥虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati）為蓼科植物虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.Et Zucc）的干燥根莖和根，虎杖性微寒、味微苦，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效。現(xiàn)代研究表明，虎杖含有多種生物活性成分，具有抗菌、抗病毒等作用[3，4]。為了尋求有效的防治新城疫的藥物，我們采用雞胚接種試驗(yàn)對(duì)虎杖的抗NDV效果進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，虎杖煎煮液在體外具有極好的抗NDV作用。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?虎杖 ?中藥飲片，購(gòu)自濟(jì)南宏濟(jì)堂藥店，經(jīng)檢驗(yàn)合格。

1.1.2 ?病毒 ?NDV F48E8株，由本所禽病研究室提供。

1.1.3 ?雞胚 ?10日齡SPF雞胚，由山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。

1.1.4 ?1%雞紅細(xì)胞懸液 ?采取成年健康SPF公雞血液，以3.8%枸椽酸鈉溶液（1：4）抗凝，加5倍生理鹽水洗滌，2000r/min離心5min，洗滌三次，取沉淀紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋而成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?虎杖提取液的制備 ?稱取200g生藥置三角瓶中，加水適量浸泡1h，置電爐上煮沸后煎煮30min，倒出藥液。再同法煎煮一次。合并藥液，濃縮藥液至200ml，使每毫升藥液相當(dāng)于含生藥lg。高壓滅菌后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用前取煎煮液置微量離心管中10000r/min離心8min，取上清液。用生理鹽水分別稀釋成1、0.8、0.6、0.4、0.2g/ml 5種不同的濃度。同時(shí)取虎杖原液10ml用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2.2 ?NDV的傳代及效價(jià)測(cè)定 ?將NDV用0.9%滅菌生理鹽水作1000倍稀釋后經(jīng)尿囊腔接種10枚SPF雞胚（0.1ml/胚）。接種后的雞胚置37℃恒溫箱培養(yǎng)96h，收獲24～96h死亡胚的尿囊液，測(cè)定HA效價(jià)。選取HA效價(jià)達(dá)1：256以上者用作試驗(yàn)病毒。

1.2.3 ?雞胚半數(shù)感染量（EID50）測(cè)定 ?按Reed- Muench法進(jìn)行[5]，試驗(yàn)采用200EID50的病毒。

1.2.4 ?虎杖提取液對(duì)雞胚的安全濃度測(cè)定 ?取以上5個(gè)稀釋度的中藥液分別接種5枚10日齡SPF雞胚，0.1ml/胚，37℃繼續(xù)孵育雞胚，觀察雞胚生長(zhǎng)發(fā)育情況。若5枚雞胚全部存活96h以上，則判定該藥物濃度對(duì)雞胚是安全的，以此確定出藥液的最大安全濃度。

1.2.5 ?雞胚接種 ?采用尿囊腔接種法[6]，按以下兩種方式進(jìn)行。同時(shí)用生理鹽水替代中藥，作為病毒對(duì)照組。

方式一，先將中藥與病毒在胚外混合作用，再接種雞胚：先將NDV稀釋成200EID50的病毒液，分別取1ml病毒液與各種最大安全濃度的中藥液1ml在微量離心管中混合，室溫下作用20min，再取混合液0.2ml尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每種藥物接種15枚雞胚。

方式二，先接種中藥，再接種病毒：先將中藥液0.1ml通過(guò)尿囊腔接種雞胚，封口，37℃孵化1h后，再接種200EID50的病毒液0.1ml，每個(gè)稀釋度的中藥液分別接種15枚雞胚。

雞胚接種完后，置37℃恒溫箱孵育96h，每日照蛋，棄去24h內(nèi)的死胚，24h以后死胚及96h后存活雞胚均置4℃冰箱保存，測(cè)定尿囊液血凝效價(jià)，并觀察胚體病理變化。記錄雞胚死亡時(shí)間、死亡數(shù)及尿囊液血凝滴度。

1.2.6 ?血凝試驗(yàn) ?采用微量凝集法[7]，在96孔V型凝集板上用微量移液器每孔加入50μL生理鹽水，再吸取尿囊液50μl于第1孔中，充分混合后再?gòu)牡?孔吸50μl至第2孔，依次作倍比稀釋，至第10孔，最后2孔分別作抗原及紅細(xì)胞對(duì)照，再吸取1%紅細(xì)胞懸液依次加入各孔，每孔50μl，至37℃溫箱作用20min，判定血凝滴度。

1.2.7 ?判定標(biāo)準(zhǔn) ?觀察胚胎變化，根據(jù)各組雞胚死亡數(shù)量、死亡時(shí)間、血凝效價(jià)，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?NDV對(duì)雞胚半數(shù)感染量的測(cè)定 ?通過(guò)測(cè)定，EID50=10-8.36/0.1ml。

2.2 ?虎杖提取液安全濃度測(cè)定結(jié)果 ?在0.2g/ml、0.4g/ml、0.6g/ml、0.8g/ml、1g/ml 5種不同的濃度下，雞胚均無(wú)出現(xiàn)死亡，表明虎杖提取液對(duì)雞胚安全性較高，藥液最大安全濃度可達(dá)1.0g/ml。

2.3 ?虎杖提取液對(duì)雞胚病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 ?第一種加藥方式（即先將中藥與病毒在胚外混合再接種雞胚）結(jié)果 ?病毒對(duì)照組雞胚48h全部死亡，死亡雞胚全身充血、出血，頭、腹、背和趾部更加明顯。藥液濃度在0.4～1.0g/ml時(shí)，試驗(yàn)組雞胚96h后均全部存活;藥液濃度為0.2g/ml時(shí)，96h后雞胚存活率為93.3%。數(shù)理統(tǒng)計(jì)表明，雞胚存活率各用藥組與病毒對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。從HA滴度來(lái)看，各藥物試驗(yàn)組HA滴度均為0，病毒對(duì)照組為9.6，差異極顯著（P<0.01）?；⒄忍崛∫簆H調(diào)節(jié)至中性后，與調(diào)節(jié)前相比，其雞胚存活率及HA滴度均無(wú)明顯差異。雞胚死亡及平均血凝滴度結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.3.2 ?第二種加藥方式（即先接種中藥，再接種病毒）結(jié)果 ?病毒對(duì)照組雞胚48h全部死亡，而各試驗(yàn)組48h時(shí)雞胚存活率為40%和60%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，48h雞胚存活率各用藥組與病毒對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。從HA滴度來(lái)看，各藥物組HA滴度均低于病毒對(duì)照組，差異顯著（P<0.05）。雞胚死亡及平均血凝滴度結(jié)果詳見(jiàn)表2。

3 ?討論

3.1 ?在兩種接種方式中，不同濃度的虎杖提取液均表現(xiàn)出了明顯的抑制NDV的效果，這表明虎杖具有較好的體外抗NDV作用，并且隨著濃度的升高其抗病毒作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

3.2 ?虎杖煎煮液pH為4.0左右，呈弱酸性。在體外抗病毒試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組雖然表現(xiàn)出了較好的抗病毒結(jié)果，但也有可能與藥液呈酸性抑制了病毒活性有關(guān)。為此，我們將虎杖原液pH調(diào)節(jié)到了中性。調(diào)節(jié)至中性后的虎杖液仍然表現(xiàn)出了很好的抗NDV效果，與虎杖原液相比并無(wú)顯著差異。這說(shuō)明虎杖提取液的抗NDV作用與pH無(wú)關(guān)，而是虎杖自身藥效的結(jié)果。

3.3 ?虎杖中主含二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類、鞣質(zhì)及多糖類化學(xué)成分。二苯乙烯類主要有白藜蘆醇（resveratro1）、虎杖苷（polydatin）及其衍生物;蒽醌類成分主要有大黃素（emodin）、大黃素甲醚、蒽苷A、蒽苷B、大黃酸、大黃酚等;黃酮類成分主要有虎杖素（reynoutrin）、槲皮素（quercetin）等[8-10]?；⒄染哂写_切的抗病毒作用，但其抗病毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)尚不太清楚，哪些成分對(duì)NDV具有抑制作用，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

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