雷林潔　楊淼　霍潘峰　王軍　馬亮英

【摘 要】 目的：建立小兒腹瀉散中沒(méi)食子酸的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Inert Sustain C18柱（250×4.6mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：271nm；流速：1.0ml·min-1；柱溫：40℃；流動(dòng)相：甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）。結(jié)果：沒(méi)食子酸在1.55～62μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，平均回收率為99.24%，RSD=0.64%。小兒腹瀉散中沒(méi)食子酸的含量為5.18mg·g-1，RSD=1.66%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可用于小兒腹瀉散中沒(méi)食子酸的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 HPLC；小兒腹瀉散；沒(méi)食子酸；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R917 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）13-0004-02

小兒腹瀉散為我院的醫(yī)院制劑（制劑批準(zhǔn)文號(hào)：新藥制字Z20040551），全方由兒茶、五倍子、清半夏、朱砂、枯礬、氫氯噻嗪等藥組成，已臨床使用多年，具有澀腸止瀉的功效，主要用于小兒“水樣便”腹瀉。處方中除兒茶具有收斂止瀉的作用外，五倍子中的鞣質(zhì)也是其止瀉的主要化學(xué)成分。多年來(lái)，鞣質(zhì)成分在醫(yī)藥領(lǐng)域被公認(rèn)為具有較強(qiáng)的收斂性及蛋白質(zhì)凝固作用，臨床上用于各種止血、止瀉及抗菌抗病毒[2]。隨著新技術(shù)、新方法的應(yīng)用，還發(fā)現(xiàn)鞣質(zhì)具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗突變、清除自由基、抗艾滋病與抗腫瘤等多種藥理活性[3]，使其在臨床中日益受到重視，也對(duì)沒(méi)食子酸的含量測(cè)定方法提出了更高的要求。中國(guó)藥典記載五倍子中鞣質(zhì)的含量以沒(méi)食子酸[1]計(jì)不低于50%。本文參照中國(guó)藥典，采用高效液相色譜法測(cè)定小兒腹瀉散中沒(méi)食子酸的含量，提高小兒腹瀉散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為更好地控制該制劑的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-M20型檢測(cè)器、 CTO-20ASVP型柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津）；電子天平（BS210S，北京賽多利斯天平有限公司，d=0.1mg）；恒溫水浴鍋（DK-S26型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高速中藥粉碎機(jī)（HX-200型，浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；超聲波清洗器（KQ500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；智能恒溫電熱套（DRT-SX型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 材料 沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201204，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；小兒腹瀉散（批號(hào)：20141224、20141226、20141228，新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院）；甲醇（sigma，色譜純）；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inert Sustain C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）；流速：1.0 ml·min-1；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：40℃，由對(duì)照品色譜（液相檢測(cè)器為二極管陣列）確定檢測(cè)波長(zhǎng)為271nm。理論板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品6.2mg，置100ml棕色量瓶中，采用50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得62μg·ml-1沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液制備[1] 精密稱取小兒腹瀉散0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25ml，稱定重量，超聲處理5min，冷卻，再次稱量重量，采用50%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液（沒(méi)食子酸濃度為62μg·ml-1）0.2、0.5、1、3、5、10ml分別置10ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒(méi)食子酸的線性回歸方程為y=29474x+4186.7，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，表明沒(méi)食子酸在1.24～62μg·ml-1范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取濃度為12.4μg·ml-1的同一對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μl，結(jié)果峰面積平均值為368037.8，RSD為0.49%，試驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于配制后1、2、3、6、9、12h進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果沒(méi)食子酸的平均峰面積為367542.8，RSD為0.15%，試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批樣品6份，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μl進(jìn)樣，供試品中沒(méi)食子酸平均含量為5.26mg·g-1，RSD為0.98%，結(jié)果表明沒(méi)食子酸含量測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品9份，分別精密加入高、中、低濃度對(duì)照品溶液各3份，按供試品溶液的制備方法制備，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為99.24%，RSD=0.64%。

2.9 樣品含量測(cè)定 照供試品溶液的制備方法分別制備3個(gè)批次的供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10μl進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算沒(méi)食子酸含量，結(jié)果3批樣品中沒(méi)食子酸平均含量為5.18mg·g-1，RSD為1.66%。

3 討論

3.1 供試品處理 [4-6] 供試品溶劑的選擇，分別采用無(wú)水乙醇、60%乙醇、甲醇、50%甲醇、純水對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取，結(jié)合液相色譜系統(tǒng)適用性的考察，確定采用50%甲醇作為提取溶劑提取效果最佳，色譜峰能夠較好的分離，而含乙醇的溶劑提取出的樣品色譜峰不能分離，無(wú)法計(jì)算峰面積。超聲提取時(shí)間的考察分別考察了5、10、15、30min，沒(méi)食子酸的含量無(wú)顯著性差異。因此，供試品的制備選用50%甲醇超聲提取5min。

3.2 流動(dòng)相的選擇[7-10] 實(shí)驗(yàn)考察了不同比例甲醇-磷酸溶液、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液作為流動(dòng)相，均能得到較好的色譜峰。其中當(dāng)甲醇-0.085%磷酸溶液（15∶85）時(shí)，出峰時(shí)間較快，但色譜峰分離度不夠。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，結(jié)合節(jié)約成本和保護(hù)色譜柱的考慮，確定采用甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）作為流動(dòng)相。

小兒腹瀉散作為我院特色制劑，療效顯著，但處方成分復(fù)雜，不僅由中西藥組合，還含有毒性藥材朱砂，因此在臨床使用與制劑質(zhì)量控制過(guò)程中應(yīng)該嚴(yán)格控制，加強(qiáng)臨床監(jiān)管，提高制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保障患兒的生命健康。本文結(jié)合制劑的特點(diǎn)，參照中國(guó)藥典中五倍子的含量測(cè)定方法，建立了小兒腹瀉散中沒(méi)食子酸的HPLC含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于小兒腹瀉散的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2015.03.23）