陳后煌 邵翔 馬玉環(huán) 鄭文偉 葉蕻芝 李西海

【摘 要】 軟骨細(xì)胞功能改變在骨關(guān)節(jié)炎病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。炎癥因子是介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的主要因素，其表達(dá)與MicroRNAs （miRNAs）密切相關(guān)。miRNAs是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非編碼蛋白的RNA分子，參與了軟骨細(xì)胞增殖、分化，以及合成與分解代謝等生物學(xué)過程。中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎獨(dú)具特色，能夠靶向調(diào)節(jié)miRNAs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，獨(dú)活寄生湯長期運(yùn)用于臨床，能有效抑制關(guān)節(jié)炎癥，其藥效機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)，以及改變miRNAs和炎癥因子之間的相互協(xié)調(diào)作用而發(fā)揮對炎癥性骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。多層次、多角度地探討?yīng)毣罴纳鷾淖饔脵C(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可為闡明獨(dú)活寄生湯治療炎癥性骨關(guān)節(jié)炎提供新的研究思路。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；獨(dú)活寄生湯；軟骨細(xì)胞；miRNAs；炎癥

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.09.016

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是多種生物因素與機(jī)械損傷因素相互作用所致生物力學(xué)紊亂而引起的病理改變[1]，并以軟骨退變?yōu)槠涓静±碜兓?。軟骨?xì)胞是軟骨中的唯一細(xì)胞，分散于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）中，對維持軟骨的完整性以及軟骨的負(fù)重功能具有重要作用。軟骨細(xì)胞功能退變，是引起OA的重要因素。獨(dú)活寄生湯能夠有效改善OA軟骨的炎性癥狀[2]，但其具體機(jī)制不甚明了?，F(xiàn)就miRNAs與炎癥性O(shè)A的關(guān)系及獨(dú)活寄生湯調(diào)控炎癥性O(shè)A的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 miRNAs調(diào)控OA軟骨細(xì)胞功能的機(jī)制

miRNAs是一類內(nèi)源性、非編碼蛋白的單鏈小RNA家族，由20～22個(gè)核苷酸組成，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等影響細(xì)胞的功能[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs表達(dá)廣泛，在OA軟骨細(xì)胞增殖、分化，以及合成與分解代謝等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。

1.1 miRNA調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖 miRNAs能夠上調(diào)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成和軟骨細(xì)胞的增殖。miR-200a特異性地在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，研究表明，miR-200a能夠下調(diào)軟骨中促軟骨細(xì)胞形成基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-200a抑制劑到發(fā)育中的下頜髁突軟骨中，則促進(jìn)了軟骨的形成，提示miR-200a可能通過調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖，抑制早期軟骨形成[5]。將雙鏈miR-21轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞后，促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖以及軟骨基質(zhì)的合成[6]。

1.2 miRNA調(diào)控軟骨細(xì)胞的分化 組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）4特異性地在非肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá)，并且通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Runx2的激活調(diào)控軟骨細(xì)胞的肥大分化。研究證實(shí)，HDAC4是miR-140的下游靶標(biāo)之一[7]，而miR-140在促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用已被證實(shí)[8]。因此，miR-140可通過抑制HDAC4的表達(dá)，從而消除HDAC4對轉(zhuǎn)錄因子Runx2的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大分化。miR-145可直接作用于其靶標(biāo)SOX-9，從而調(diào)控軟骨細(xì)胞分化的早期階段[9]。miR-145還可以特異性地降低OA軟骨ECM中Col2a1基因、蛋白聚糖和miR-140的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)軟骨細(xì)胞中Runx2和基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinases-13，MMP-13）的表達(dá)水平[10]。此外，miR-221也被證實(shí)可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化和軟骨ECM的合成[11]。

1.3 miRNA調(diào)控軟骨細(xì)胞的凋亡 軟骨細(xì)胞凋亡是引起OA的重要分子事件，眾多miRNAs參與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡過程。白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）誘導(dǎo)的OA模型中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的數(shù)量隨著miR-34a水平的增加而增加，表明miR-34a可能與軟骨細(xì)胞的過度凋亡有關(guān)，當(dāng)使用miR-34a抑制劑或者沉默miR-34a后，軟骨細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象出現(xiàn)明顯的改善[12]。IL-1β介導(dǎo)的OA模型中，miR-145呈高表達(dá)，miR-145通過調(diào)控Smad3繼而影響后者下游基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞ECM的降解[13]。與之相反的是，在相同OA模型中，miR-127-5p的表達(dá)量降低并伴隨MMP-13的表達(dá)量上升。而過表達(dá)的miR-127-5p則可以抑制MMP-13的產(chǎn)生，并且減緩OA軟骨退變進(jìn)程[14]。miR-27a通過減少M(fèi)MP-1和IGFBP5的合成，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，從而間接調(diào)控OA的病理進(jìn)程[15]。

2 miRNAs調(diào)控炎癥性O(shè)A的機(jī)制

2.1 炎癥介質(zhì)參與OA軟骨細(xì)胞功能改變的機(jī)制 炎癥介質(zhì)對OA的發(fā)病進(jìn)展具有重要影響，其中，細(xì)胞因子在OA發(fā)病中的作用越來越受關(guān)注，其在OA軟骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。IL-1和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是OA病理過程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的最主要細(xì)胞因子，對維持關(guān)節(jié)軟骨ECM的降解與合成平衡具有關(guān)鍵作用[16]。IL-1分為IL-1α和IL-1β兩種亞型，它們生物活性相似，具有相同的致炎能力，其中IL-1β在整個(gè)OA進(jìn)程中處于核心地位。

OA中存在明顯的軟骨細(xì)胞凋亡。參與炎癥介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡信號通路有：一氧化氮（nitric oxide，NO）途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）通路等。NO是IL-1β作用于軟骨細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，正常軟骨細(xì)胞中無NO產(chǎn)生，IL-1β等可以激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide，iNOS）產(chǎn)生大量NO，后者可引起體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。IL-1通過激活NF-κB途徑，影響細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞合成MMPs、NO和蛋白聚糖酶等，最終引起關(guān)節(jié)炎癥和軟骨細(xì)胞凋亡[18]。另外，IL-1可直接引起線粒體功能異常、能量衰竭，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。TNF-α在OA軟骨中表達(dá)上調(diào)，其通過激活MAPK信號下游的MEK/ERK信號通路，抑制促合成代謝因子SOX-9、蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[19]。

2.2 miRNAs參與調(diào)控炎癥性O(shè)A的軟骨細(xì)胞功能改變 miRNAs廣泛參與OA的炎癥反應(yīng)過程，尤其是炎癥因子介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡[20]。在OA軟骨中，存在著某種由透明質(zhì)酸、纖連蛋白、膠原或蛋白聚糖等分子揭示的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式，這些分子能被TOLL樣受體（TLRs）以一種外源性病原相關(guān)分子模式識別[21-22]。TOLL樣受體信號能夠激活NF-κB信號，后者能夠誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，繼而誘發(fā)OA的炎癥反應(yīng)[23]。同樣，促炎細(xì)胞因子IL-1能夠激活NF-κB信號，因此IL-1可能通過調(diào)控基因的表達(dá)，在關(guān)節(jié)軟骨的分解代謝中發(fā)揮重要作用。

眾多miRNAs參與了對這些信號通路的調(diào)控。miR-155通過靶向調(diào)節(jié)TGF-β激活的蛋白激酶1結(jié)合蛋白2，抑制TGF-β激活的蛋白激酶1，繼而抑制NF-κB和MAPK信號，從而負(fù)向調(diào)節(jié)TLR/IL-1介導(dǎo)的炎癥性通路[24]。miR-146a則通過激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)蛋白激酶1和TNF受體相關(guān)因子6，減少M(fèi)MP-13、ADAMTS-5對Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解，抑制上述炎癥性通路的激活[25-26]。IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的其他miRNAs包括miR-194和miR-27b等[27-28]。

3 獨(dú)活寄生湯治療炎癥性O(shè)A的機(jī)制探討

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，其發(fā)病機(jī)制分為虛實(shí)兩類，氣血虛弱、肝腎虧虛，則筋骨失養(yǎng)，即不榮則痛，屬虛證；風(fēng)寒濕邪侵襲，則經(jīng)絡(luò)氣血瘀阻，即不通則痛，屬實(shí)證。OA核心病機(jī)為本痿標(biāo)痹，病在筋骨，病位在肝腎。肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)而為痿；腠理空虛易感風(fēng)寒濕之邪而為痹[29]。基于OA本痿標(biāo)痹的病理特點(diǎn)，治以補(bǔ)腎柔肝為主（治痿），輔以祛風(fēng)除濕散寒（治痹）。

3.1 獨(dú)活寄生湯的立論依據(jù) 獨(dú)活寄生湯出自唐·孫思邈的《備急千金要方》，方藥由獨(dú)活9 g，桑寄生、牛膝、肉桂、當(dāng)歸、干地黃、杜仲、芍藥、細(xì)辛、川芎、秦艽、防風(fēng)、人參、茯苓、甘草各

6 g組成。獨(dú)活長于祛下焦風(fēng)寒濕邪，蠲痹止痛，為君藥。肉桂溫里祛寒，通利血脈；秦艽、防風(fēng)祛風(fēng)勝濕；細(xì)辛祛寒止痛，均為臣藥。川芎、干地黃、當(dāng)歸養(yǎng)血活血；桑寄生、杜仲、牛膝、芍藥補(bǔ)腎柔肝，強(qiáng)壯筋骨；人參、茯苓、甘草補(bǔ)氣健脾，扶助正氣；以上各藥均為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，為使藥。本方以祛風(fēng)寒濕藥為主，輔以補(bǔ)肝腎、養(yǎng)氣血、行氣活血、通絡(luò)止痛之品，邪正兼顧。諸藥相伍，使風(fēng)寒濕邪俱除，氣血充足，肝腎強(qiáng)健，痹痛得以緩解[30]。獨(dú)活寄生湯具有扶正祛邪、標(biāo)本兼顧的特點(diǎn)，體現(xiàn)中醫(yī)學(xué)“以通為用”的治療原則，故為臨床治療OA的經(jīng)典名方之一[31]。

3.2 獨(dú)活寄生湯治療炎癥性O(shè)A的藥理基礎(chǔ) 軟骨退變是OA的主要病理特征，是多因素綜合作用引起的軟骨細(xì)胞、軟骨下骨及軟骨基質(zhì)降解與合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果。炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)降解是引起OA 軟骨退變的關(guān)鍵因素，也在OA的病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。IL-1β、TNF-α等誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨退變，在OA發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，抑制炎癥因子對軟骨的破壞，成為治療OA的重要途徑。

有學(xué)者對補(bǔ)腎活血法的研究顯示，活血中藥與補(bǔ)腎中藥均能保護(hù)OA軟骨細(xì)胞及維持軟骨的完整性，延緩軟骨內(nèi)膠原的破壞及性質(zhì)改變，抑制關(guān)節(jié)軟骨炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對OA起治療作用?；钛铒L(fēng)、補(bǔ)腎柔肝類中藥復(fù)方能通過影響OA關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的炎癥因子、MMPs、自由基等，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的退變與降解，進(jìn)而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、防治OA的作用。另有研究表明，具有活血化瘀、泄?jié)岢凉窆πУ男節(jié)岢詼軌蛞种萍?xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[32]。以上研究結(jié)果均為補(bǔ)腎活血、祛風(fēng)除濕類復(fù)方治療炎癥性O(shè)A提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)。

獨(dú)活寄生湯以獨(dú)活、秦艽、防風(fēng)、肉桂、細(xì)辛祛風(fēng)除濕散寒，而祛風(fēng)除濕散寒藥能抗炎、鎮(zhèn)痛，通過調(diào)控細(xì)胞因子之間的相互作用，參與調(diào)控影響軟骨細(xì)胞功能變化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)降解與合成的平衡[33]；川芎、干地黃、人參、當(dāng)歸、茯苓、甘草活血補(bǔ)血，益氣健脾，而益氣活血藥可以降低骨內(nèi)壓、改善骨內(nèi)微循環(huán)，以及骨內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，并且可能通過提高SOD活性，抑制NO生成，阻止NO、自由基對軟骨細(xì)胞的破壞，其中，NO通過介導(dǎo)炎性因子，促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解，誘導(dǎo)軟骨的退變[34]；桑寄生、杜仲、牛膝、芍藥補(bǔ)腎柔肝，強(qiáng)筋壯骨，補(bǔ)腎柔肝藥能多層次地調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸功能及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，上調(diào)性激素水平，調(diào)節(jié)異常的細(xì)胞因子水平，抑制滑膜炎癥，延緩軟骨細(xì)胞的功能退變，調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解，參與調(diào)控軟骨退變[29，31]?，F(xiàn)代藥理研究表明，獨(dú)活寄生湯具有以下作用：抗炎，鎮(zhèn)痛；擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)；免疫調(diào)節(jié)；改善滑膜組織病理形態(tài)[35-36]。

研究表明，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)功效的補(bǔ)陽還五湯能夠下調(diào)miR-221、miR-222的表達(dá)水平[37]。

活血化瘀、泄?jié)岢凉竦男節(jié)岢詼軌蛘{(diào)控多種miRNAs的表達(dá)，通過調(diào)控miR-146a的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)[32]。補(bǔ)腎活血方可以下調(diào)miR-210的表達(dá)水平[38]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯通過抑制IL-1、IL-6、TNF-α和MMP-13等的表達(dá)水平，減少炎癥因子對關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變[39-41]，而miRNAs與IL-1、IL-6和TNF-α等誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)[42-43]。以上種種研究結(jié)果表明，具有補(bǔ)腎柔肝、祛風(fēng)除濕散寒之功效的獨(dú)活寄生湯在治療炎癥性O(shè)A時(shí)，可能同時(shí)伴有對miRNAs的調(diào)控過程。

4 結(jié) 語

綜上所述，基于miRNAs與炎癥因子在調(diào)控炎癥性O(shè)A軟骨細(xì)胞功能的過程中相互影響、相互作用，且研究已證實(shí)，獨(dú)活寄生湯能夠有效改善炎癥性O(shè)A患者臨床癥狀，有效抑制IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子引起的軟骨退變，延緩OA的病理進(jìn)程。我們有理由相信，獨(dú)活寄生湯可能通過調(diào)節(jié)OA軟骨細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)，以及改變miRNAs和炎癥因子之間的相互協(xié)調(diào)作用而發(fā)揮對炎癥性O(shè)A的治療作用。

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收稿日期：2015-05-31；修回日期：2015-07-30