毛和平，路寧維，謝六生，劉光斌，董鈺明

1酒鋼醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅嘉峪關(guān)735100；2蘭州大學(xué)藥學(xué)院；

3淮陰工學(xué)院江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點實驗室

乳沒接骨丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

毛和平1，路寧維2，3，謝六生1，劉光斌1，董鈺明2△

1酒鋼醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅嘉峪關(guān)735100；2蘭州大學(xué)藥學(xué)院；

3淮陰工學(xué)院江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點實驗室

目的：建立乳沒接骨丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法對制劑中沒藥、續(xù)斷、紅花和土鱉蟲進行定性鑒別；采用薄層色譜法對紅花和當(dāng)歸進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中補骨脂素和異補骨脂素含量。色譜柱為Iner tsi l C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-水(52∶48，v/v)；流速為0.80mL/min；檢測波長為246 nm。結(jié)果：顯微鑒別結(jié)果清晰；薄層色譜斑點清晰，分離度良好，陰性無干擾，專屬性強，重復(fù)性良好；補骨脂素和異補骨脂素分別在5.20～83.6μg/mL(r=0.999 1)和4.95～79.2μg/mL(r=0.9995)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；平均回收率分別為99.1%(RSD=1.55%，n=9)和99.5%(RSD=2.08%，n=9)。結(jié)論：本方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，可用于乳沒接骨丸的質(zhì)量控制。

乳沒接骨丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；補骨脂素；異補骨脂素；顯微鑒別；薄層色譜；高效液相色譜

乳沒接骨丸是在酒鋼醫(yī)院使用多年的固定處方基礎(chǔ)上，進一步應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)方法，經(jīng)多年基礎(chǔ)實驗研究和五年以上臨床應(yīng)用研究，根據(jù)現(xiàn)代制劑工藝制備的水泛丸。由乳香、沒藥、紅花、當(dāng)歸、自然銅、補骨脂、川續(xù)斷和土鱉蟲8味藥物組成，經(jīng)粉碎、加工制成中藥丸劑，具有活血化瘀、消腫生肌、續(xù)筋接骨之功效。臨床上主要用于跌打損傷、筋斷骨折、瘀滯腫痛的治療。

乳香和沒藥活血止痛，消腫生肌為君藥［1-4］；當(dāng)歸和紅花活血化瘀，疏通經(jīng)脈為臣藥［5-7］；土鱉蟲破血逐瘀，續(xù)筋接骨為佐藥［8-9］；自然銅、補骨脂，川續(xù)斷助土鱉蟲續(xù)筋接骨為使藥［10-13］，全方活血化瘀，消腫生肌，續(xù)筋接骨為主。

本實驗采用顯微鑒別方法對制劑中沒藥、紅花、續(xù)斷和土鱉蟲進行鑒別；采用薄層色譜法(TLC)對紅花和當(dāng)歸進行鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)測定補骨脂素和異補骨脂素的含量，為全面有效控制乳沒接骨丸的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

戴安Dinonex Ul timate 3000高效液相色譜儀，二極管陣列紫外檢測器，手動進樣器，Chromeleon色譜工作站(美國Dionex公司)；Inertsi l C18(150×4.6 mm，5μm)色譜柱；分析天平(上海奧豪斯Discovery專業(yè)性分析天平)；KH-300DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Motic B5系列無限遠校正光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡(麥克迪奧實業(yè)集團有限公司)；ZF-3型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。

自制乳沒接骨丸(批號：20110201、20110202、20110203)；紅花對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：120907-201010)；當(dāng)歸對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：120927-201014)；補骨脂素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110739-200814)；異補骨脂素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110738-201012)；甲醇(色譜純，山東禹王試劑)；二次重蒸餾水(蘭州大學(xué)GLP實驗中心)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別［14］取乳沒接骨丸，研細，挑取適量樣品，置載玻片中央，滴加水合氯醛試液2滴，透化后制片。置顯微鏡下觀察：不規(guī)則碎塊淡黃色，半透明，滲出油滴，加熱后油滴溶化，現(xiàn)正方形草酸鈣結(jié)晶(沒藥)；草酸鈣簇晶甚多，直徑15～50μm，散在或存在于皺縮的薄壁細胞中，有時數(shù)個排列成緊密的條狀(續(xù)斷)；花粉粒類圓形、橢圓形或橄欖形，直徑約至60μm，具3個萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起。草酸鈣方晶存在于薄壁細胞中，直徑2～6μm(紅花)；體壁碎片黃色或棕紅色，有圓形毛窩，直徑8～24μm，可見長短不一的剛毛，有的具縱直紋理(土鱉蟲)，見圖1。

圖1 乳沒接骨丸顯微鑒別圖譜

2.2 TLC鑒別

2.2.1 紅花TLC鑒別［14］取乳沒接骨丸適量，碾碎，稱取粉末2.0 g，加80%丙酮溶液6mL，密塞，振搖15分鐘，靜置，取上清液作為供試品溶液。另取紅花對照藥材粉末0.5 g，加80%丙酮溶液5mL。同法制成對照藥材溶液。另按處方比例制備不含紅花的陰性制劑，同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠HF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開劑，展開，取出，晾干，觀察斑點。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照品在此處無干擾，見圖2。

圖2 乳沒接骨丸中紅花TLC色譜圖

2.2.2 當(dāng)歸的TLC鑒別［14］取乳沒接骨丸適量，碾碎，稱取粉末6.0 g，加甲醇20mL，超聲處理(120W，40 kHz)15分鐘，濾過，濾液濃縮至1mL，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液。另按處方比例制備不含當(dāng)歸的陰性制劑，同法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實驗，吸取上述兩種溶液各1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品在此處無干擾，見圖3。

圖3 乳沒接骨丸中當(dāng)歸TLC色譜圖

2.3 補骨脂素和異補骨脂素HPLC測定［14］

2.3.1 色譜條件Iner tsi l C18色譜柱(150mm× 4.6mm，5μm)，以甲醇-水(52∶48，v/v)為流動相，檢測波長為246 nm，柱溫25℃，流速0.80mL/min，進樣量10μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取補骨脂素和異補骨脂素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1mL中約各含10μg的溶液，即得對照品溶液。

2.3.3 供試品及陰性對照品溶液的制備 取乳沒接骨丸適量，研細，取粉末約5.0 g(相當(dāng)于補骨脂0.50 g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，密塞，超聲處理40分鐘(120W，40 kHz)，待冷卻至室溫后濾過，并用甲醇洗滌3次，10mL/次，濾液再經(jīng)微孔濾膜(0.22μm)濾過，最后定容至100mL量瓶中，用流動相稀釋1倍，即得供試品溶液。取按處方比例及工藝制備缺補骨脂樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.3.4 專屬性實驗 分別取對照品溶液，供試品溶液及陰性對照品溶液，按“2.3.1”項色譜條件進樣分析。結(jié)果表明，供試品溶液在該色譜條件下分離度良好，陰性無干擾，見圖4。

圖4 乳沒接骨丸HPLC色譜圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取補骨脂素和異補骨脂素對照品各約20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。精密量取該溶液適量，加流動相分別稀釋25、50、100、200、400倍，分別得到5個濃度的對照品溶液。0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.3.1”項色譜條件測定峰面積。分別取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。以對照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積平均值(A)為縱坐標(biāo)，計算，得回歸方程。補骨脂素和異補骨脂素的回歸方程分別為A=3.742 93C+81.277 01 (r=0.999 1)和A=1.59 802 C+39.091 63(r=0.999 5)。結(jié)果表明，補骨脂素在濃度為5.20～83.6μg/mL范圍內(nèi)，異補骨脂素在濃度為4.95～79.2μg/mL范圍內(nèi)，其濃度與色譜峰峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10μL，按上述條件重復(fù)測定6次，結(jié)果補骨脂素和異補骨脂素峰面積RSD分別為1.25%(n=6)和1.38% (n=6)，保留時間RSD分別為0.15%(n=6)和0.12% (n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液分別于0，2，6，8，12小時測定補骨脂素和異補骨脂素的含量，測得峰面積RSD分別為1.59%(n=5)和 1.90%(n=5)，保留時間RSD分別為0.18%(n=5)和0.15%(n=5)。結(jié)果表明供試品溶液在12小時內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性實驗 取同一批號(20110201)樣品6份，按“2.3.3”項下供試品制備方法分別處理，按“2.3.1”項色譜條件測定樣品中補骨脂素和異補骨脂素的含量，測得補骨脂素和異補骨脂素含量RSD分別為1.34%(n=6)和1.47%(n=6)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率實驗 取已測定的乳沒接骨丸樣品(批號：20110201)9份，每份約5.0 g，精密稱定，分別精密加入一定量的補骨脂素和異補骨脂素對照品，按“2.3.3”項下制備樣品，測定補骨脂素和異補骨脂素的含量，分別計算回收率，見表1—2。

2.3.10 含量測定 取3個不同批號(批號：20110201、20110202、20110203)樣品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取10μL，依法測定補骨脂素和異補骨脂素的含量，結(jié)果3批樣品中補骨脂素和異補骨脂素的含量(g/g)分別為0.046%和0.037%，0.047%和0.038%，0.048%和0.039%。

表1 乳沒接骨丸中補骨脂素加樣回收率實驗(n=9)

表2 乳沒接骨丸中異補骨脂素加樣回收率實驗(n=9)

3 討論

3.1 TLC鑒別 在紅花和當(dāng)歸TLC鑒別時，分別從溫度(15℃、25℃和30℃)，濕度(15%、25%和35%)以及不同薄層板(青島裕民源和手鋪板)3個方面考察了方法耐用性，結(jié)果斑點清晰，分離度良好，分離無明顯差異，表明方法耐用性良好。

3.2 HPLC含量測定 補骨脂具有促進骨骼再生與重建、抗癌活性和提高免疫系統(tǒng)功能等作用［15］。補骨脂素和異補骨脂素均是補骨脂的有效成分。補骨脂素可促進成骨細胞的增殖與分化成熟，并抑制破骨細胞活性，發(fā)揮促進骨形成和抑制骨吸收的雙重作用［11］。異補骨脂素能促進骨髓充質(zhì)干細胞向成骨細胞方向分化［16］。《中國藥典》2010年版一部收載了補骨脂原藥材中補骨脂素和異補骨脂素的含量測定方法，本研究對該方法進行了優(yōu)化，建立了一種靈敏、專屬可靠的高效液相色譜法測定制劑中的補骨脂素和異補骨脂素的含量。

3.3 含量限度 《中國藥典》2010年版一部收載的補骨脂原藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“本品按干燥品計算，含補骨脂素(C11H6O3)和異補骨脂素(C11H6O3)的總量不得少于0.70%。”補骨脂在乳沒接骨丸處方中占10%，忽略工藝因素，可計算在該制劑中補骨脂素和異補骨脂素的總量應(yīng)為0.070%?？紤]制備工藝中的損失量，按原藥材的80%計算，補骨脂素和異補骨脂素在該制劑中的總含量不得低于0.056%。

因此，乳沒接骨丸中補骨脂素和異補骨脂素的含量限度暫定為“本品每丸含補骨脂以補骨脂素(C11H6O3)和異補骨脂素(C11H6O3)的總量計，不得少于0.056%。”

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Research on theQuality Standard of RuMo JieGu Pills

MAO Heping1,LU Ningwei2,3,XIE Liusheng1,LIU Guangbin1,DONG Yuming2△
1 Pharmacy School of Jiugang Hospital,Jiayuguan 735100,China;
2 Pharmacy School of Lanzhou University;
3 Jiangsu Provincial Key Laboratory for InterventionalMedical Devices in Huaiyin Institute of Technology

Objective:To formulate the quality standard for RuMo JieGu pills.Methods:The qualities of Moyao(Commiphora myrrha Eng1.),Xuduan(Radix Dipsaci),Honghua(Carthamus tinctorius L.),and Tubiechong (Eupolyphaga seu Steleophaga)in the pillswere identified bymicroscopic examination;the naturesof Honghua and Danggui were detected by thin layer chromatography(TLC);the contentsof psoralen and isopsoralenweremeasured by high performance liquid chromatography(HPLC).The operating conditionsby HPLCwere InertsilC18 column (150mm×4.6mm,5μm),v(methanol)/v(water)=52/48 asmobile phase,0.80m L/m in as flow speed and wavelength 246 nm.Results:The resultsobserved bymicroscopy were obvious;the TLC spots developed were clearw ith efficientseparating ability,whichwere negative noninterferencew ith the characteristicsofhigh specificity and satisfactory reproducibility;the linear relation between psoralen among 5.20 and 83.6μg/m L(r=0.999 1)and the isopsoralen from 4.95 to 79.2μg/m L (r=0.999 5)was excellent;the average recoveries of psoralen and isopsoralen were 99.1%(RSD=1.55%，n=9)and 99.5%(RSD=2.08%，n=9),respectively.Conclusion:M icroscopy,TLC and HPLC arehandy,safeand accurate for RuMo JieGu pills to determine the quality.

RuMo JieGu pills;quality standard;psoralen;isopsoralen;microscopic identification;TLC;HPLC

R284.1

A

1004-6852(2015)01-0018-05

2014-01-06

江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點實驗室開放基金資助項目(編號j r l209)。

毛和平(1965—)，男，副主任中藥師。研究方向：中藥制劑。

△通訊作者：董鈺明(1971—)，男，博士學(xué)位，碩士研究生導(dǎo)師，副教授。研究方向：藥物分析。