左小淑 王彬 徐建 付雷 陸宇

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·論著·

結(jié)核分枝桿菌對氯法齊明耐藥的體外誘導(dǎo)實驗研究

左小淑 王彬 徐建 付雷 陸宇

目的 利用濃度梯度倍增的氯法齊明(clofazimine, Cfz)體外誘導(dǎo)獲得結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)耐藥株，并進(jìn)行耐藥機(jī)制的初步研究。 方法 選取Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，從亞最低抑菌濃度 (sub-minimal inhibitory concentration，sub-MIC)[1/8 MIC(按照Cfz的MIC值為0.12 μg/ml配置)、1/4 MIC、1/2 MIC…]開始，在Cfz濃度倍增的7H11固體培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，逐步誘導(dǎo)菌株對Cfz的耐藥性，并通過藥物敏感性試驗和全基因組測序來進(jìn)行驗證；同時利用Alamar blue微板分析法 (microplate Alamar blue assay，MABA)測定誘導(dǎo)耐藥菌株對10種抗結(jié)核藥物(INH、RFP、EMB、Mfx、Lzd、Cs、Cm、TMC207、TBI-166、Cfz)的MIC情況。 結(jié)果 Mtb標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)誘導(dǎo)后對Cfz的MIC值是誘導(dǎo)前的32～64倍(誘導(dǎo)前Cfz的MIC值是0.12 μg/ml)。對10種抗結(jié)核藥物敏感性試驗顯示，Cfz誘導(dǎo)耐藥菌株對TMC207(Bendaquiline)及TBI-166產(chǎn)生交叉耐藥。耐藥株在7H9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行無藥連續(xù)培養(yǎng)10代后，測定其MIC值無明顯變化，MIC數(shù)值都穩(wěn)定在32 MIC～64 MIC之間，對此誘導(dǎo)耐藥株進(jìn)行全基因組測序共檢測到195個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisma，SNP)突變和19個插入缺失(InDel)突變。 結(jié)論 從亞MIC藥物濃度開始，逐漸遞增的長期藥物刺激能夠誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌對氯法齊明的獲得性耐藥，獲得的耐藥株耐藥性穩(wěn)定。

結(jié)核分枝桿菌； 氯法齊明； 抗藥性, 細(xì)菌； 體外研究

WHO最新報告2013年全球結(jié)核病(TB)新發(fā)患者估計達(dá)900萬例，其中多耐藥結(jié)核病(MDR-TB)48萬例(包括3.5%新發(fā)患者和20.5%曾接受過抗結(jié)核治療患者)，并且耐藥程度逐年增加，耐藥結(jié)核病治療效果不佳[1]。面對臨床多藥耐藥結(jié)核病患者的逐年遞增和無藥可選的尷尬境地，自2008年WHO在抗結(jié)核藥物治療指南中公布氯法齊明(clofazimine, Cfz)可作為第五組抗結(jié)核藥物應(yīng)用以來，該藥被越來越廣泛地應(yīng)用于臨床，尤其是與一線或多種二線抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療耐藥結(jié)核病[2-5]，Cfz臨床耐藥的情況也逐漸出現(xiàn)甚至呈逐漸增加趨勢[6]，需要引起高度重視。

在TB猖獗的發(fā)展中國家，耐藥結(jié)核病患者中Cfz耐藥的發(fā)生率逐漸升高[7]。Cfz不同于其他抗結(jié)核藥物，其作用靶點目前尚不清楚；另外，由于Cfz的臨床耐藥情況尚不穩(wěn)定，臨床耐藥分離株較難獲取[8-9]，故本研究擬通過實驗室人工體外誘導(dǎo)Cfz耐藥菌株，為進(jìn)一步研究Cfz的作用機(jī)制和耐藥機(jī)制提供幫助，對于干預(yù)Cfz耐藥的發(fā)生、指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義。

材料和方法

一、材料

1. 菌株：Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)為北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存菌株。

2. 試劑及培養(yǎng)基：7H9、7H11培養(yǎng)基為美國碧迪醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(albumin dextrose catalase，ADC) 和阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)為英國AbD Serotec公司產(chǎn)品,4 ℃避光保存；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)為成都化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8255/8256)為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

3. 儀器： 恒溫培養(yǎng)箱為上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品，型號ZHWY-100B；生物安全柜為美國Esco公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為Infinite 200 PRO為瑞士Tecan產(chǎn)品；NanoDrop2000為美國 Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品。

4. 藥物：異煙肼(INH，批號:SLBC3024V)、利福平(RFP，批號:080M1506V)、乙胺丁醇(EMB，批號:050M0034),均為美國Sigma公司產(chǎn)品；莫西沙星(Mfx，批號:BXFZG31)為德國Bayer公司產(chǎn)品；利奈唑胺(Lzd)、環(huán)絲氨酸(Cs)、卷曲霉素(Cm)購自中國生物制品檢定所；Cfz購自南京立業(yè)制藥有限公司；貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq 或 TMC207)為全球結(jié)核病藥物研發(fā)聯(lián)盟(TB Alliance)惠贈、TBI-166為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所惠贈。INH、EMB、Cs用滅菌蒸餾水溶解,其余藥用DMSO溶解，溶解后以0.22 μm濾膜過濾,-80 ℃保存。

5. 培養(yǎng)基的制備：配置7H11含藥(Cfz)瓊脂培養(yǎng)基和不含藥兩種培養(yǎng)基。Cfz含藥培養(yǎng)基的濃度梯度分別為：1/8最低抑菌濃度(MIC)(按照Cfz的MIC值為0.12 μg/ml配置)、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC……64 MIC。

二、 方法

1. Cfz的MIC和臨床耐藥界點(clinical breakpoints)的確定： 采用微孔板阿爾瑪藍(lán)測定法(microplate alamar blue assay，MABA)對Cfz進(jìn)行最低抑菌濃度的測定[10], Cfz終濃度設(shè)置為0.03～3.84 μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv終濃度為5×105菌落形成單位(CFU)/ml，測定Cfz對標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC數(shù)值。

2. 體外誘導(dǎo)耐藥實驗： 取凍存于-80 ℃超低溫培養(yǎng)箱中H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株400 μl，加入到含有30 ml新鮮配置的7H9溶液和75 μl 20%吐溫80溶液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，充分混勻后置于37 ℃溫箱中復(fù)蘇2～3周，待其生長至對數(shù)生長期,備用。

取該生長狀態(tài)下的菌懸液200 μl，用酶標(biāo)儀測其吸光度A570 nm(A570 nm=0.1相當(dāng)于108CFU/ml)，然后用7H9液體培養(yǎng)基稀釋至107CFU/ml，取100 μl稀釋后菌懸液分別接種到5個含Cfz濃度為1/8 MIC(0.015 μg/ml)7H11固體培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3周；觀察菌株生長情況，再將生長菌落研磨后稀釋至107CFU/ml，取100 μl分別接種到5個含Cfz濃度為1/4 MIC(0.03 μg/ml)7H11固體培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3周；觀察菌株生長情況，再將生長菌落研磨后稀釋至107CFU/ml，取100 μl分別接種到5個含Cfz濃度為1/2 MIC(0.06 μg/ml)7H11固體培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3周；觀察菌株生長情況，按照Cfz濃度倍增制備含藥培養(yǎng)基，重復(fù)上述流程，依次傳代，直至培養(yǎng)基中無或僅有極少量結(jié)核分枝桿菌生長為止，記錄觀察結(jié)果。每次傳代均設(shè)立3個不含藥培養(yǎng)基作為對照。

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]的要求，若誘導(dǎo)后的MIC值是誘導(dǎo)前的8倍以上，認(rèn)為誘導(dǎo)耐藥成功。本研究將Cfz臨床耐藥界點設(shè)定為>1 μg/ml[12]。

繼續(xù)將獲得的耐藥菌株在不含藥培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代，連續(xù)傳10代，期間先后進(jìn)行3次MIC實驗，驗證其MIC數(shù)值是否穩(wěn)定在一定范圍。

3.DNA提取及全基因組測序：對獲得的誘導(dǎo)耐藥菌株進(jìn)行基因組抽提，按照試劑盒(sk8255)提供的說明書進(jìn)行操作，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000對抽提的基因組質(zhì)量和純度進(jìn)行驗證。將合格的樣品送至北京康普森有限公司進(jìn)行全基因組測序，使用Hiseq2500 測序平臺(Illumina Ⅱ代測序技術(shù)) 對樣品進(jìn)行測序，通過BWA 軟件和 Samtools軟件比較測序數(shù)據(jù)對參考基因組 NC000962.3 的覆蓋情況,判斷樣品與參考序列的近緣情況。對單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)/插入或者缺失(insertion/deletion, InDel)突變進(jìn)行檢測及統(tǒng)計。

4.誘導(dǎo)耐藥菌株對其他抗結(jié)核藥物的敏感性： 從7H11固體培養(yǎng)基上選取結(jié)核分枝桿菌H37Rv和Cfz誘導(dǎo)耐藥菌株培養(yǎng)2～3周的培養(yǎng)物制成菌懸液，接種到含20%吐溫80、10%ADC的7H9培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)1～2周，生長至濁度為McFarland 1(相當(dāng)于107CFU/ml)時，1∶20稀釋后，加入各孔100 μl，菌液的終濃度為106CFU/ml。藥物的濃度范圍分別為：INH 0.015～0.5 μg/ml，RFP 0.015～0.5 μg/ml，EMB 0.25～8 μg/ml，Mfx 0.06～2 μg/ml，Lzd 0.03～1 μg/ml，Cs 3.125～100 μg/ml，Cm 0.3～10 μg/ml，TMC207 0.125～4 μg/ml，TBI-166 0.05～1.6 μg/ml，Cfz 0.12～3.84 μg/ml。每板均設(shè)2個不含抗菌藥的生長對照孔。96孔板置于37 ℃溫箱孵育。6 d后向各實驗藥物孔和生長對照孔內(nèi)均加入20 μl的10×Alamar blue和12.5 μl 的20%吐溫80混合液，37 ℃ 溫箱中孵育24 h；記錄各孔的顏色，藍(lán)色孔為無生長，粉紅色孔為有生長，紫紅色孔再繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)24 h(若不變?yōu)榉奂t色、且其相連的藍(lán)色孔仍為藍(lán)色，則記錄為有生長)。MIC定義為阻止顏色變化(從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色)的最低藥物濃度。

結(jié) 果

一、 MIC測定結(jié)果

通過MABA法測定標(biāo)準(zhǔn)菌株對Cfz的MIC數(shù)值，確定Cfz的MIC數(shù)值為0.12 μg/ml。

二、 體外誘導(dǎo)耐藥實驗

隨著Cfz藥物濃度的梯度遞增，結(jié)核分枝桿菌生長的菌落明顯減少，64 MIC(7.68 μg/ml)時僅有極少量細(xì)小菌落生長。對獲得的該菌落進(jìn)行藥物敏感性試驗，進(jìn)行了3次以上的 MIC測定，發(fā)現(xiàn)其MIC數(shù)值是誘導(dǎo)前的32～64倍，可以判斷該方法可以成功誘導(dǎo)Cfz的獲得性耐藥。

三、 DNA提取及全基因組測序分析

通過對誘導(dǎo)耐藥菌株進(jìn)行全基因組測序，并與H37Rv基因組NC000962.3 進(jìn)行序列比對，共檢測到195個SNP突變位點和19個InDel突變位點，195個SNP突變位點中分別包含63個非同義突變(non-Syn)、65個同義突變(Syn)和67個基因間區(qū)(intergenic)變異(表1)。19個InDel位點突變中，9個為編碼序列(coding sequence, CDS)區(qū)域內(nèi)可以引起讀碼框移位的突變，1個為不引起讀碼框的移位的突變；9個為基因間區(qū)的變異(表1)。分析位于CDS區(qū)的10個插入缺失突變(表2)，其中3個介導(dǎo)代謝與呼吸過程(Rv0197等)，2個為PE/PPE蛋白家族成員，其余分別參與信號通路、參與細(xì)胞壁和細(xì)胞合成、假設(shè)蛋白等。分析位于CDS區(qū)的128個SNP突變，有38個屬于PE或PPE蛋白家族成員，1個參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(Rv0890c)，14個假設(shè)蛋白，26個調(diào)節(jié)代謝與呼吸過程(Rv0869c,Rv2097c)，17個參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，17個參與脂質(zhì)代謝的基因，15個參與細(xì)胞壁和細(xì)胞合成的基因(表3)。

表1 不同突變位點與區(qū)域的SNP和InDel注釋結(jié)果

注 數(shù)字是指發(fā)生SNP或InDel突變的位點個數(shù)；“-”指未檢測

表2 不同插入缺失突變基因的InDel突變基因功能注釋

四、交叉耐藥實驗

通過交叉耐藥實驗測定誘導(dǎo)后的耐藥菌株對10種藥物INH、RFP、EMB、Mfx、Lzd、Cs、Cm、TMC207、TBI-166、Cfz的MIC，發(fā)現(xiàn)獲得的誘導(dǎo)耐藥菌株對TMC207、 TBI-166等產(chǎn)生了交叉耐藥(表4)。

討 論

抗結(jié)核藥物療程長、患者依從性差、藥物不良反應(yīng)等因素，是產(chǎn)生耐藥性的重要原因[13-14]，抗結(jié)核藥

表3 不同SNP突變基因注釋

注 表中括號內(nèi)的數(shù)值表示同一基因位點同一基因發(fā)生突變的個數(shù)

表4 本研究不同抗結(jié)核藥物的交叉耐藥試驗結(jié)果

物的耐藥機(jī)制研究一直是研究的熱點和難點。本研究采用人工誘導(dǎo)耐藥的方法，通過菌株在藥物濃度不斷增加的選擇壓力下，由敏感到耐藥的演變過程，成功獲得了體外誘導(dǎo)的氯法齊明耐藥菌株，為其耐藥機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，為臨床合理用藥提供了可靠的理論依據(jù)。

與以往研究者篩選耐藥株的方法不同[15-16]，本研究從亞MIC濃度開始，以Cfz濃度梯度倍增的含藥固體培養(yǎng)基對Mtb的標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行體外人工誘導(dǎo)耐藥試驗，最終成功將Mtb標(biāo)準(zhǔn)株誘導(dǎo)為對Cfz耐藥，并對TMC207、TBI-166等產(chǎn)生了交叉耐藥。雖然該誘導(dǎo)菌株對INH、 RFP的MIC數(shù)值也有所增高，但未達(dá)到CLSI規(guī)定的耐藥標(biāo)準(zhǔn)，且全基因組測序中并沒有發(fā)現(xiàn)katG、inhA、rpoB等常見的耐藥突變位點。

該研究結(jié)果表明，在逐漸增加藥物濃度的長期刺激下，Mtb可以產(chǎn)生對Cfz的獲得性耐藥，并會產(chǎn)生對其他吩嗪類藥物(如TBI-166)的交叉耐藥，同時也對喹啉類藥物(如TMC207)產(chǎn)生交叉耐藥。這就提示臨床醫(yī)生在耐藥結(jié)核病臨床治療中應(yīng)該謹(jǐn)慎使用這類藥物，避免獲得性耐藥和交叉耐藥的產(chǎn)生。

那么，用該誘導(dǎo)方法獲得的Cfz獲得性耐藥菌株對Mtb的耐藥穩(wěn)定性如何，是否會回復(fù)為敏感菌株，還是會一直持續(xù)耐藥，目前尚未見相關(guān)報道。我們進(jìn)一步將最后誘導(dǎo)獲得的耐藥菌株繼續(xù)在不含藥的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代10代，期間進(jìn)行了3次MIC實驗驗證，其MIC數(shù)值基本穩(wěn)定，保持在32 MIC～64 MIC之間；證實其為非適應(yīng)性生長，從全細(xì)胞水平證實了采用MIC倍遞增的方法對Mtb進(jìn)行體外耐藥性的誘導(dǎo)是成功的，同時也表明通過該誘導(dǎo)方法獲得的Cfz耐藥菌株的穩(wěn)定性較強(qiáng)，其機(jī)制可能與Mtb修復(fù)其適應(yīng)性損失的代償性進(jìn)化密切相關(guān)[17]。

本研究對誘導(dǎo)耐藥菌株進(jìn)行全基因組測序，將測序數(shù)據(jù)與參考基因組NC000962.3(Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株)進(jìn)行比對后，共檢測到195個SNP突變位點和19個InDel突變，說明該耐藥菌株的基因型已經(jīng)發(fā)生了改變，這就從基因分子水平上證實了耐藥菌株的誘導(dǎo)是成功的。

在該誘導(dǎo)菌株的SNP突變中，檢測到了Rv0678(編碼假設(shè)蛋白)的突變，這與最新的一些報道是吻合的。Hartkoorn等[18]研究報道了Cfz體外誘導(dǎo)耐藥株與 TMC207可以產(chǎn)生顯著的交叉耐藥，并且初步推測耐藥產(chǎn)生的原因是由于調(diào)節(jié)基因Rv0678的突變上調(diào)了外排泵編碼基因MmpL5[19]；Somoskovi等[20]在1例MDR-TB患者的治療過程中觀察到類似的交叉耐藥現(xiàn)象。目前認(rèn)為該突變基因可能參與了Cfz耐藥的發(fā)生。對于其他突變基因，是否參與了Cfz耐藥性的發(fā)生發(fā)展，目前尚未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)報道，其中某些基因可能參與了Cfz耐藥過程，我們將通過后續(xù)有關(guān)實驗來進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

就現(xiàn)有研究結(jié)果分析，Cfz也是外排泵作用的底物，其耐藥與Rv0678基因突變導(dǎo)致外排泵相關(guān)基因MmpL5過表達(dá)有關(guān)。另一方面，MmpL5作用的這一類藥物(clofazimine, bedaquiline)具有一些共性，這些化合物在作用機(jī)制上均作用于或影響著電子傳遞的過程，MmpL5是否僅特異作用于具有這一特點的化合物呢？尚需要進(jìn)一步深入研究。

本研究通過體外誘導(dǎo)實驗，成功獲得了對Cfz耐藥的Mtb耐藥株，并且通過全基因組測序證實了這一點，SNP突變中的Rv0678基因突變已有多處報道與Cfz耐藥相關(guān)。同時，通過該誘導(dǎo)耐藥菌株對10種常用抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗，證實了該菌株對TBI-166、TMC207等藥物產(chǎn)生了明顯的交叉耐藥性，這不僅對于指導(dǎo)臨床合理選用抗結(jié)核藥物具有實際意義，而且為更加深入地研究吩嗪類藥物的耐藥機(jī)制提供了思路。

當(dāng)然，本研究尚存在一些不足：首先，本研究誘導(dǎo)了一批耐藥菌株，并對該誘導(dǎo)菌株進(jìn)行了全基因組測序，有必要誘導(dǎo)幾批菌株，進(jìn)行重測序驗證，加強(qiáng)實驗的可靠性。但由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，以及Cfz耐藥誘導(dǎo)需要周期長等原因，多批誘導(dǎo)需要較多時間投入。對重測序中發(fā)現(xiàn)的突變基因及其功能探究，以及這些突變基因與Cfz耐藥機(jī)制的發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系，尚需要進(jìn)一步進(jìn)行反復(fù)驗證和深入研究。目前，本實驗室已經(jīng)對第二批誘導(dǎo)菌株進(jìn)行了重測序，同時選取了Cfz臨床耐藥株進(jìn)行重新測序，結(jié)果見后續(xù)相關(guān)報道。

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(本文編輯：范永德)

In vitro induction ofMycobacteriumtuberculosisresistance to clofazimine

ZUOXiao-shu,WANGBin,XUJian,FULei,LUYu.

DepartmentofPharmacology,BeijingKeyLaboratoryforDrugResistanceTuberculosisResearch,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

LUYu,Email:luyu4876@hotmail.com

Objective To inductMycobacteriumtuberculosis(Mtb) resistant strains in vitro by using gradient multiplied concentration of clofazimine (Cfz) and study the preliminary mechanisms of resistance. Methods We subcultured Mtb standard strains H37Rv to 7H11 solid medium with doubled Cfz concentrations from the beginning of sub-MIC concentrations (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC...) and induced Cfz-resistance gradually. Than we tested the resistance through drug susceptibility testing and whole genome sequencing. Meanwhile, We measured the MICs of the induced resistant strains to ten anti-TB drugs(INH，RFP，EMB，Mfx，Lzd，Cs，Cm，TMC207，TBI-166，Cfz). Results MIC values of the Mtb standard strain after induction were 32 to 64 times higher than before (0.12 μg/ml), The drug susceptibility testing also showed that Cfz had a cross-resistance to TMC207 (Bendaquiline) and TBI-166; MIC values of the Mtb resistent strain was stable among 32 MIC to 64 MIC after continuously cultivating 10 generations in drug-free 7H9 liquid medium. We also detected 195 single nucleotide polymorphism (SNP) mutations and 19 insertion deletion (InDel) mutations in this resistant strain by whole genome sequencing. Conclusion Cfz resistent strain can be obtained by the long-term drug-induced stimulation from the beginning of sub-MIC concentrations to gradually increasing the concentrations. The resistent strain had a stable characteristic.

Mycobacteriumtuberculosis； Clofazimine； Drug resistance, bacterial； In vitro

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.012

“十二五”國家科技重大專項(2012ZX09301002-005-003)；北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項經(jīng)費資助(ZYLX201304)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院耐藥結(jié)核病研究北京市重點實驗室 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物研究室

陸宇，Email:luyu4876@hotmail.com

2015-02-04)