黃艷君 譚耀駒 蔡杏珊 劉燕文 竺澎波

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·論著·

γ-干擾素釋放試驗(yàn)在肺結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌肺病診斷的價(jià)值

黃艷君 譚耀駒 蔡杏珊 劉燕文 竺澎波

目的 評(píng)估γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)在診斷肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)與非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)肺病中的價(jià)值。 方法 收集2013年3月至2014年6月期間廣州市胸科醫(yī)院住院患者214例，共分3組：PTB組87例，NTM肺病組70例和其他肺部疾病組57例。應(yīng)用結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)試劑盒進(jìn)行γ-干擾素釋放試驗(yàn)，檢測(cè)各組外周血淋巴細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌種特異性分泌蛋白：早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)分泌蛋白10(CFP-10)的免疫反應(yīng)情況。 結(jié)果 T-SPOT.TB結(jié)果顯示87例肺結(jié)核患者77例陽性(陽性率88.51%)，70例NTM肺病患者16例陽性(陽性率22.86%)，57例其他肺部疾病患者13例陽性(陽性率為22.81%)，PTB組T-SPOT.TB 陽性率明顯高于NTM肺病組(χ2=69.23，P<0.01)和其他肺部疾病組(χ2=63.42，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而NTM肺病組和其他肺部疾病組陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00，P=1.00)。 結(jié)論 T-SPOT.TB可快速輔助診斷肺結(jié)核和NTM肺病。

干擾素γ釋放試驗(yàn)； 結(jié)核, 肺/診斷； 分枝桿菌感染, 非結(jié)核； 肺疾病

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)與非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)肺病的細(xì)菌學(xué)診斷主要有抗酸菌涂片鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)和菌種鑒定等常規(guī)方法，這不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要手段，同時(shí)也是確診結(jié)核病和NTM肺病、選擇治療方案、考核療效及評(píng)價(jià)防治效果的金標(biāo)準(zhǔn)。但以上方法一直存在陽性率低、耗時(shí)長(zhǎng)的問題，其缺點(diǎn)在NTM肺病的診斷中尤為突出。目前診斷NTM的技術(shù)還十分滯后，最突出的是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制較差，導(dǎo)致分枝桿菌假陽性率和假陰性率升高；實(shí)驗(yàn)室菌種鑒定水平不高，使得近1/4的NTM肺病誤診為結(jié)核病[1]?？梢?，傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法在總體上已不能滿足結(jié)核病與NTM肺病的診斷及鑒別診斷。所以，準(zhǔn)確、快速及簡(jiǎn)便的早期診斷技術(shù)是NTM肺病診斷亟待解決的問題。γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)目前已經(jīng)列入美國(guó)和歐洲等地結(jié)核病診療指南，以協(xié)助診斷結(jié)核分枝桿菌感染的存在[2-3]。本研究回顧分析2013年3月至2014年6月廣州市胸科醫(yī)院的住院患者進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)檢測(cè)情況，結(jié)合臨床診斷，評(píng)估其在肺結(jié)核和NTM肺病診斷中的價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集2013年3月至2014年6月在廣州市胸科醫(yī)院分枝桿菌培養(yǎng)菌種鑒定確診為肺結(jié)核的患者87例，年齡9～91歲，平均年齡為(49.72±20.51)歲。NTM肺病患者70例，年齡19～87歲，平均年齡為(61.01±14.56)歲，菌種鑒定分別是：胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)20例、龜-膿腫復(fù)合群分枝桿菌(M.chelona/abscessuecomplex) 28例、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii) 8例、鳥-胞內(nèi)復(fù)合群分枝桿菌(M.avium-intracellularecomplex, MAC) 5例、鳥分枝桿菌(M.avium)9例；排除結(jié)核病和NTM肺病的其他肺部疾病患者57例，年齡4～94歲，平均年齡為(47.19±21.58)歲，包括：肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細(xì)菌性肺炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等?；颊叩脑\斷標(biāo)準(zhǔn)及臨床一般情況見表1。

二、方法

入組的214例，均進(jìn)行血T-SPOT.TB檢測(cè)。

1. γ-干擾素釋放試驗(yàn)：根據(jù)試劑盒(T-SPOT.TB, Oxford Immunotec公司，英國(guó))說明書進(jìn)行操作，從外周靜脈血中分離出單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，在每個(gè)預(yù)包被抗γ-干擾素抗體的孔中加入2.5×105個(gè)PBMCs，分別與兩種抗原[早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)分泌蛋白10(CFP-10)]共同孵育16～20 h，利用堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗和底物顯色后，使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)讀板儀對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2. 質(zhì)量控制：IGRA實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制為確保每個(gè)反應(yīng)孔有均一定量的細(xì)胞數(shù)，每一反應(yīng)均分別設(shè)有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，對(duì)照孔正常(陰性孔≤10個(gè)，陽性孔≥20個(gè))的情況下，按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。陽性結(jié)果: (1) 如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<6個(gè), 檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)>6; (2)如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè), 檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)必須>2倍的空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。反之，為陰性結(jié)果。陰性或陽性對(duì)照異常，試驗(yàn)均視為無效。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析參數(shù)包括敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽性似然比和陰性似然比，用χ2檢驗(yàn)比較組間的差異性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

T-SPOT.TB在不同組別的檢測(cè)情況：PTB組陽性率88.51%、NTM肺病組陽性率22.86%、其他肺部疾病組陽性率22.80%。數(shù)據(jù)顯示，PTB組的陽性率明顯高于另外2個(gè)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)(表2～4)。

表1 214例不同肺部疾病患者性別、年齡和診斷依據(jù)

注 肺結(jié)核診斷參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS288-2008)[4]執(zhí)行；肺外結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌肺病參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì)《肺結(jié)核診斷和治療標(biāo)準(zhǔn)》[4]執(zhí)行；a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細(xì)菌性肺炎和COPD等，依據(jù)國(guó)家相關(guān)的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。①是微生物學(xué)確診；②是指南確診；③是臨床診斷；M.intracellulare：胞內(nèi)分枝桿菌；M.chelona/abscessuecomplex：龜-膿腫復(fù)合分枝桿菌；M.kansasii：堪薩斯分枝桿菌；M.avium-intracellularecomplex (MAC)：鳥-胞內(nèi)復(fù)合分枝桿菌；M.avium：鳥分枝桿菌

表2 PTB組與NTM肺病組的T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果比較

注 PTB組與NTM肺病組比較：χ2=69.23，P=0.00；敏感度為88.51%，特異度為77.14%，陽性預(yù)測(cè)值(PPV)為82.80%，陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為84.38%,陽性似然比(LR+)為4.81，陰性似然比(LR-)為0.19，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

表3 PTB組與其他肺部疾病組的T-SPOT.TB 檢測(cè)結(jié)果比較

注 PTB組與其他肺部疾病組比較：χ2=63.42，P=0.00；敏感度為88.51%，特異度為77.19%， 陽性預(yù)測(cè)值(PPV)為85.56%，陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為81.48%, 陽性似然比(LR+)為5.92， 陰性似然比(LR-)為0.23，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細(xì)菌性肺炎和COPD等

表4 NTM肺病組與其他肺部疾病組的T-SPOT.TB 檢測(cè)結(jié)果比較

注 NTM肺病組與其他肺部疾病組比較：χ2=0.00，P=1.00；差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原體性肺炎、肺真菌感染、細(xì)菌性肺炎和COPD等

討 論

一、 目前實(shí)驗(yàn)室診斷PTB和NTM肺病的主要方法

對(duì)于肺結(jié)核的診斷，主要是依靠患者的癥狀、結(jié)核病接觸史、影像學(xué)檢查、PPD皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test, TST；結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn))及痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。PPD皮試試驗(yàn)檢測(cè)特異度較低，同時(shí)不能排除NTM的感染[5]；其次，TST對(duì)潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的敏感度一般，而且對(duì)于免疫抑制者的檢測(cè)結(jié)果難以確定。而痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)雖為診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但較為費(fèi)時(shí)且陽性率較低。另一方面，目前對(duì)疑似NTM肺病的患者，在細(xì)菌學(xué)上的診斷方法主要是留取相應(yīng)病變部位標(biāo)本進(jìn)行涂片的抗酸染色和分枝桿菌培養(yǎng)，在菌種鑒定結(jié)果出來以前，結(jié)果也與肺結(jié)核結(jié)果相似，容易導(dǎo)致誤診。對(duì)患者而言，耽誤最佳治療時(shí)間的同時(shí)，也消耗了大量費(fèi)用甚至可能會(huì)對(duì)身體造成一定程度的傷害。

二、T-SPOT.TB的檢測(cè)原理及本研究的相關(guān)數(shù)據(jù)分析

T-SPOT.TB是利用結(jié)核分枝桿菌感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞中存在結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在再次受到結(jié)核分枝桿菌特有的DNA片段所編碼的ESAT-6和CFP-10刺激后分泌γ-干擾素而設(shè)計(jì)的T細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，與卡介苗、特別是非結(jié)核分枝桿菌無交叉反應(yīng)，因此，具有非常高的敏感度和特異度[4-5]，同時(shí)可以檢測(cè)到還沒有臨床癥狀的LTBI患者，很多研究已經(jīng)證實(shí)了此原理可應(yīng)用于結(jié)核病、包括肺外結(jié)核的輔助診斷[7-10]及結(jié)核病的排查。

本研究顯示，菌陽PTB組T-SPOT.TB試驗(yàn)陽性率為88.51%，能明顯與涂陽、培陽的NTM肺病組(陽性率為22.86%)進(jìn)行鑒別診斷，兩組比較：敏感度為88.51%，特異度為77.14%，陽性預(yù)測(cè)值(PPV)為82.80%，陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為84.38%,陽性似然比(LR+)為4.81，陰性似然比(LR-)為0.19，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。在其他肺部疾病組中，T-SPOT.TB試驗(yàn)陽性率為22.81%，明顯低于PTB組，兩組比較：敏感度為88.51%，特異度為77.19%，PPV為85.56%，NPV為81.48%，LR+為5.92， LR-為0.23差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.00)?？梢?，T-SPOT.TB可以應(yīng)用于PTB與其他體征和檢查結(jié)果相似的疾病，特別是NTM肺病的早期鑒別診斷[11]；當(dāng)然，更可作為PTB診斷的一項(xiàng)重要的篩查指標(biāo)。通過對(duì)NTM肺病組和肺部其他疾病組的T-SPOT.TB結(jié)果比較，顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)，說明T-SPOT.TB在其他肺部疾病患者和NTM肺病患者中的檢測(cè)結(jié)果情況基本一致。T-SPOT.TB目前主要的試驗(yàn)標(biāo)本是靜脈血和胸腹積液，標(biāo)本留取簡(jiǎn)單、方便且合格率高，試驗(yàn)過程中提取經(jīng)洗滌的定量PBMCs進(jìn)行孵育刺激，去除了外源干擾素干擾的同時(shí)也使結(jié)果更準(zhǔn)確。

綜上所述，T-SPOT.TB在結(jié)核病與NTM肺病的診斷過程中有快速、敏感度及特異度較高的優(yōu)點(diǎn)[11]，在臨床上對(duì)疑似肺結(jié)核的患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)鑒別診斷是有幫助的。此外，由于胸腔積液中免疫反應(yīng)的強(qiáng)度比血液中更高，因此有些試驗(yàn)通過檢測(cè)胸腔積液中的γ-干擾素釋放水平來診斷活動(dòng)性胸膜結(jié)核[12]，這些嘗試被證實(shí)是有意義的。對(duì)于本試驗(yàn)結(jié)果的反應(yīng)強(qiáng)度與病情的相關(guān)性，目前仍存在較大的爭(zhēng)議。本試驗(yàn)全過程只要2 d時(shí)間，取材簡(jiǎn)便且合格率高，但鑒于目前T-SPOT費(fèi)用還比較高，在一定程度上限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用。

[1] 肖和平.關(guān)注非結(jié)核分枝桿菌感染的危害性.中華結(jié)核和呼吸雜志，2012,35(8)：563.

[2] Lalvani A．Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy. Chest, 2007, 131(6):1898-1906.

[3] Mazurek GH, Jereb J, Lobue P, et al. Guidelines for using the QuantiFERON-TB Gold test for detectingMycobacteriumtuberculosisinfection, United States. MMWR Recomm Rep, 2005, 54(RR-15): 49-55.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)，《中華結(jié)核和呼吸雜志》編輯委員會(huì).非結(jié)核分枝桿菌病診斷與專家共識(shí).中華結(jié)核和呼吸雜志，2012, 35(8)：572-580.

[5] Richeldi L. An update on the diagnosis of tuberculosis infection. Am J Respir Crit Care Med, 2006, 174(7): 736-742.

[6] Pai M, Zwerling A, Menzies D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Ann Intern Med, 2008, 149(3): 177-184.

[7] Denkinger CM, Dheda K, Pai M. Guidelines on interferon-γ release assays for tuberculosis infection: concordance, discor-dance or confusion? Clin Microbiol Infect, 2011, 17(6): 806-814.

[8] Kim SH, Song KH, Choi SJ, et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immuncompromised patients. Am J Med, 2009, 122(2): 189-195.

[9] Feng Y, Diao N, Shao L, et al. Interferon-gamma release assay performance in pulmonary and extrapulmonary tuberculosis. PLoS One, 2012, 7(3): e32652.

[10] Lee YM, Park KH, Kim SM, et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay in patients with miliary tuberculosis compared with those with lymph node tuberculosis. Clin Infect Dis, 2013, 56(2): 26-29.

[11] Latorre I, De Souza-Galv?o M, Ruiz-Manzano J, et al. Eva-luating the non-tuberculous mycobacteria effect in the tuberculosis infection diagnosis. Eur Respir, 2010, 35(2): 338-342.

[12] Baba K, S?rnes S, Hoosen AA, et al. Evaluation of immune responses in HIV infected patients with pleural tuberculosis by the QuantiFERON TB-Gold interferon gamma assay. BMC Infect Dis, 2008, 8(1)：35-38.

(本文編輯：范永德)

Performance of the γ-interferon release assay in diagnosing tuberculosis and nontuberculous mycobacteria

HUANGYan-jun，TANYao-ju,CAIXing-shan,LIUYan-wen,ZHUPeng-bo.

GuangzhouChestHospitalClinicalLaboratory,Guangzhou510095,China

TANYao-ju,Email:gzchtan@163.com

Objective To evaluate the value of interferon-gamma release assays (IGRAs) for diagnosing pulmonary tuberculosis (PTB) and nontuberculous mycobacteria (NTM). Methods A total of 214 in-patients were enrolled in this study between March 2013 and June 2014. The patients were divided into three groups: 87 PTB cases, 70 NTM cases and 57 cases with other lung diseases. T-SPOT.TB was used to detect the immune response of peripheral blood lymphocytes against tuberculosis-specific secretory proteins ESAT-6 and CFP-10. Results T-SPOT.TB tests were positive in 77 (88.51%) of the 87 TB cases, 16 (22.86%) of the 70 NTM cases, and 13 (22.81%) of the 57 cases with other lung diseases. The positive detection rate for the TB group was significantly higher than that for the NTM group (χ2=69.23，P<0.01) and other lung disease group (χ2=63.42，P<0.01). However, there was no significant difference in the positive detection rate between the NTM and other lung disease groups (χ2=0.00，P=1.00). Conclusion T-SPOT.TB can be used as an alternative auxiliary diagnostic method for distinguishing PTB and NTM patients.

Interferon-gamma release tests； Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Mycobacterium infections, nontuberculous； Lung diseases

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.007

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201508020007)

510095 廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科

譚耀駒，Email：gzchtan@163.com

2015-04-30)