賈輝　胡蘭　馬曉威

摘 要：依賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（HDA）是近年來發(fā)明的一種新型的模擬動(dòng)物體內(nèi)DNA復(fù)制的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，HDA具有簡便、高效、快速的優(yōu)點(diǎn)，不需復(fù)雜的科學(xué)儀器，反應(yīng)在常溫下進(jìn)行，適用于基層實(shí)驗(yàn)室，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：依賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；DNA解旋酶；單鏈DNA結(jié)合蛋白

依賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（HDA），是美國NEB公司在2004年發(fā)明的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。依賴解旋酶DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是模擬動(dòng)物體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，不需要在昂貴的PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，僅在恒溫水浴鍋上使用即可完成反應(yīng)。

1 HDA 的原理

HDA的原理極其簡單，首先用解旋酶解開雙鏈DNA，然后依靠單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）與模板單鏈相結(jié)合，使模板單鏈?zhǔn)冀K處于單鏈狀態(tài)，同時(shí)保護(hù)它的完整性，然后模板與引物進(jìn)行雜交，在DNA聚合酶的催化下進(jìn)行擴(kuò)增，新合成的雙鏈DNA作為模板繼續(xù)擴(kuò)增。

2 HDA檢測方法的建立要點(diǎn)

2.1 模板的選擇

一般情況下，解旋酶的解旋能力決定著可擴(kuò)增序列長度。HDA選用的是大腸桿菌解旋酶Ⅱ（UvrD）解旋酶，UvrD的解鏈速度是20bp/秒，連續(xù)性是100bp，因此進(jìn)行擴(kuò)增的模板長度為70～120bp。

2.2 酶的選擇

目前常用的解旋酶是大腸桿菌解旋酶Ⅱ（UvrD），UvrD在核酸的核苷酸的切除修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)中起到了重要的解旋作用，UvrD是由720個(gè)氨基酸組成的，是SF1解旋酶家族一員。還有一種新發(fā)現(xiàn)的解旋酶—T7噬菌體基因4編碼蛋白，解鏈速度是300bp/秒，擴(kuò)增質(zhì)粒DNA的長度是2.5kb，它的解鏈速度比UvrD更快，擴(kuò)增長度更長。目前常用的SSB包括T4噬菌體基因32編碼蛋白和RB49噬菌體基因32編碼蛋白；常用的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶或者是Klenow Fragment（3′-5′exo-）聚合酶。

2.3 引物設(shè)計(jì)

引物的最適長度是25～27bp，最大不超過33bp，Tm值在60～72℃，GC含量35%～44%。

3 HDA的反應(yīng)體系及操作步驟

3.1 HDA的反應(yīng)體系

HDA反應(yīng)體系包括混合物A和混合物B，混合物A包括引物、模板、ddH2O、緩沖液；混合物B包括SSB、UvrD、三磷酸脫氧核糖核苷、DNA聚合酶、MutL和緩沖液。

3.2 HDA的操作程序

HDA的操作程序有兩種做法：兩步法和一步法。兩步法：混合物A放在95℃水浴加熱2分鐘；然后在64℃水浴中3分鐘退火；加入與混合物A等體積的混合物B，置于60～65℃水浴鍋中反應(yīng)75～90分鐘，加入終止反應(yīng)液結(jié)束反應(yīng)。

一步法：操作過程比兩步法更簡單，省去兩步法中的第一步，等體積混合混合A、混合物B，放在65℃的水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增。

4 HDA技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

4.1 HDA的優(yōu)點(diǎn)

和其他的等溫基因擴(kuò)增技術(shù)比較，HDA技術(shù)更加的簡便、高效、快速，是一種正真做到在恒溫下進(jìn)行反應(yīng)的擴(kuò)增技術(shù)。HDA擴(kuò)增的反應(yīng)時(shí)間75～90分鐘，整個(gè)反應(yīng)在恒溫下進(jìn)行，只需要恒溫水浴鍋這一簡單儀器，與其他基因擴(kuò)增技術(shù)相比，適用于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)疾病的快速檢測與診斷。HDA反應(yīng)除去了5′～3′外切酶活性的BstDNA聚合酶，該操作不容易產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增，增加反應(yīng)的敏感性。

4.2 HDA的缺點(diǎn)

HDA是近幾年新發(fā)明的一種等溫基因擴(kuò)增技術(shù)，研究者較少，且發(fā)展還不夠成熟，目前還沒有在基因擴(kuò)增等方面的應(yīng)用。

5 應(yīng)用與展望

與其他技術(shù)相比，HDA技術(shù)簡便、高效、快速，適用性廣泛，在實(shí)時(shí)定量方法、凝膠電泳和ELISA實(shí)驗(yàn)中都可應(yīng)用，同時(shí)適用于基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)疾病的快速檢測與診斷。已有研究通過對(duì)HDA體系的優(yōu)化，成功建立了RT-tHDA檢測方法。有研究表明，HDA能夠擴(kuò)增cDNA、微生物基因組DNA等基因片段，因其具有簡便性、高效性、快速性等優(yōu)點(diǎn)，該方法具有廣闊的研究和發(fā)展前景。因?yàn)镠DA的反應(yīng)是完全在恒溫下進(jìn)行，特別適用于基層實(shí)驗(yàn)室，隨著HDA這種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的快速發(fā)展，會(huì)有專門適于HDA操作的簡單儀器出現(xiàn)。

HDA技術(shù)是模擬動(dòng)物體內(nèi)DNA的合成方式，具有高保真性和高敏感性。2006年New Englang Bio-labs在HDA的原有的基礎(chǔ)上又發(fā)明了一種新的檢測方法，即環(huán)HDA法，該方法不但可擴(kuò)增大分子DNA片段，還可直接擴(kuò)增完整的cDNA。該方法的發(fā)現(xiàn)為分子生物學(xué)再一次提供新的科研手段。該方法使基因的擴(kuò)增和基因的篩選同時(shí)完成，分析和構(gòu)建質(zhì)粒DNA的時(shí)間逐步減少，更加有效的加快了反應(yīng)的速度并且提高了DNA的產(chǎn)量。cHDA法利用T7基因4蛋白使反應(yīng)溫度僅在25℃反應(yīng)，因此在室溫條件下即可完成擴(kuò)增，不需要加熱，操作更加簡單方便。

目前已經(jīng)有對(duì)腹瀉性梭狀芽胞桿菌用HDA方法檢測的報(bào)道。但HDA這種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)受DNA解旋酶結(jié)合、延伸長度和解旋速度影響，模板靶序列超過400bp會(huì)顯著降低擴(kuò)增效率，DNA解旋酶對(duì)擴(kuò)增效果影響很大，今后的研究重點(diǎn)將是如何篩選出優(yōu)質(zhì)的DNA解旋酶。