文婧，孫洪章，盧靜華（遼寧醫(yī)學院研究生學院，遼寧 錦州 121000）

中藥丁公藤[1]為旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.或光葉丁公藤[2]Erycibe schmidtii Craib的干燥藤莖[3]，為廣東、廣西民間用于抗風濕的傳統(tǒng)藥，是廣西壯族民間傳統(tǒng)用藥，有祛風除濕、消腫止痛[4]的作用，可用于風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、半身不遂和跌打腫痛。目前所檢測到關于丁公藤藥材的文獻大多是對其進行含量測定，暫時沒有利用指紋圖譜[5]技術進行質(zhì)量控制的研究。為控制和保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術指南（試行）》，本課題組對12批不同地區(qū)的丁公藤藥材進行了特征圖譜分析和相似度的計算，該方法能夠從整體上控制丁公藤藥材的質(zhì)量，達到鑒別真?zhèn)蝃6-7]、評定藥材優(yōu)劣的目的，可為藥材的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

L-2000型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1311A型四元梯度泵、WLJYQ型進樣器、G1315A型二極管陣列檢測器（日本日立公司）；KQ-100A型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；GM-0.33A型無油真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）；1810-B型石英自動雙重純水蒸餾器（江蘇宏華儀器廠）；BSA224S型電子天平（德國賽多利斯集團）。

1.2 試劑

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:110753-200413，純度≥99%）；東莨菪苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號:20120910，純度≥99%）；東莨菪內(nèi)酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:110768-200504，純度≥99%）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

所有藥材樣品均經(jīng)過遼寧醫(yī)學院藥學院生藥科承偉教授鑒定，為旋花科植物丁公藤E.obtusfolia Benth或光葉丁公藤E.schmidtii Craib的干燥藤莖。樣品來源詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Hypersil ODS C18（200mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），采用梯度洗脫，梯度洗脫程序詳見表2；流速:1.0ml/min；檢測波長:347nm；柱溫:30 ℃；進樣量:20μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以綠原酸峰計，不低于3000，分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備

表1 樣品來源Tab 1 Samples’origins

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution programs

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取東莨菪苷[8]、東莨菪內(nèi)酯[9-10]、綠原酸[11]對照品3.60、3.99 、4.12mg，分別配制成每1ml含0.360、0.399、0.412mg的對照品溶液。再分別精密量取上述3種溶液各2.5ml，置于25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.0360、0.0399、0.0412mg/ml的混合對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液 稱取丁公藤藥材細粉（過四號篩）約2.5 g，置于具塞錐形瓶中，放置過夜，稱定質(zhì)量，超聲（功率:100 W，頻率:40 kHz）提取30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，以半徑為3 cm、3500 r/min離心10min，定容于25ml量瓶中，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 參照峰的選擇

精密量取“2.2”項下供試品溶液（批號:110501）和混合對照品溶液各20μl，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，詳見圖1。丁公藤藥材經(jīng)HPLC分析出現(xiàn)多個色譜峰，以綠原酸色譜峰（S）作為參照峰。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液20μl，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄各共有色譜峰的保留時間和峰面積。結(jié)果，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸的峰面積的RSD分別為1.33%、0.96%、1.85%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批次丁公藤藥材（批號:110501）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，分別于配制0、2、4、8、16、24h時進行測定。結(jié)果，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸的峰面積的RSD分別為2.12%、1.35%、1.41%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術要求。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品（批號:110501）；3.東莨菪苷；4.綠原酸；6.東莨菪內(nèi)酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample（lot No.110501）；3.scopolamine glycosides；4.chlorogenic acid；6.scopoletin

2.4.3 重復性試驗 取同一批次丁公藤藥材（批號:110501）適量，按“2.2.2”方法制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸峰面積的RSD分別為0.21%、1.35%、1.87%，表明本方法重復性良好，符合指紋圖譜的技術要求。

2.4.4 特征圖譜的建立及評價 取12批不同產(chǎn)地的丁公藤藥材各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。根據(jù)12批樣品特征圖譜的特點，可以確定10個峰作為共有特征峰，并標定了其中的3個色譜峰，其中3號峰為東莨菪苷峰，4號峰為綠原酸峰，6號峰為東莨菪內(nèi)酯峰，這3個峰分離度較好，保留時間適宜，因此可以作為參照峰（東莨菪苷峰、綠原酸峰、東莨菪內(nèi)酯峰是丁公藤藥材的有效成分，后來含量測定測的就是東莨菪苷、綠原酸和東莨菪內(nèi)酯的含量。“2.3”項中“以綠原酸色譜峰（S）作為參照峰”，這是選擇峰面積最大的綠原酸峰作為參考來標定10個峰的），色譜見圖1（B）。將各批丁公藤藥材的特征圖譜信號導入國家藥典委員會主持開發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版）》，計算生成對照特征圖譜，12批藥材特征圖譜的共有模式詳見圖2，共有峰的相對保留時間和相對峰面積值詳見表3，并計算對照圖譜和12批樣品圖譜之間的相似度數(shù)據(jù)，相似度計算結(jié)果詳見表4。相似度在0.90以上認為符合要求，為推薦品；0.90以下的為非推薦品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第7批和第11批樣品相似度小于0.90，不推薦使用。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

試驗中考察了100%、50%甲醇超聲提取法和100%、50%乙醇超聲提取法[12]及100%乙醇的加熱回流提取方法。結(jié)果表明，100%甲醇超聲提取法中大部分峰能在色譜圖中真實體現(xiàn)，故選此法。

3.2 檢測波長的選擇

圖2 12批丁公藤藥材的特征圖譜Fig 2 Fingerprint of 12 batches of E.obtusifolia

對丁公藤的甲醇超聲提取液進行全波長掃描，結(jié)果最大吸收波長在299、347nm處。分別以254、299、326、347nm為檢測波長，記錄色譜圖，結(jié)果在347nm波長下的色譜圖中出峰數(shù)目較多，且各峰信號大小比較均勻，分離度較好。綜合考慮，選擇347nm作為丁公藤藥材特征圖譜的檢測波長。

3.3 流動相的選擇

試驗分別以甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫，記錄色圖譜。結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，特征峰出現(xiàn)時間較晚，且峰形稍有拖尾；為使避免峰型拖尾，在有機相乙腈中加入0.1%的磷酸，可以看出譜圖特征峰出現(xiàn)時間適宜，且峰形明顯較好、分離度好、基線漂移小，因此以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，在347nm處進行檢測，能獲得很好的分離效果。

表3 12批樣品特征圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積值Tab 3 Relative retention time and relative peak area of common peaks of characteristic spectrum of 12 batches of samples

表4 12批藥材HPLC特征圖譜相似度分析結(jié)果Tab 4 Result of similarity analysis of fingerprints of 12 batches of samples

本試驗對不同產(chǎn)地的12批丁公藤藥材進行了特征圖譜研究[13]，用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版）》進行分析，得到了丁公藤藥材的對照用特征圖譜，以及12批藥材相對于對照特征圖譜的相似度。結(jié)果表明，本方法簡便、準確、重復性好，可為有效地控制丁公藤藥材的內(nèi)在質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

[1]劉卉，楊錦芬，詹若挺.丁公藤研究概況與展望[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2012，39（1）:36.

[2]宋蔚，金蓉鸞，劉繼華.光葉丁公藤化學成分的研究[J].中國中藥雜志，1997，22（6）:359.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:3-4.

[4]周名璐，許少偉，程新敏.復方丁公藤膠囊的消炎鎮(zhèn)痛作用[J].中成藥，1993，15（7）:29.

[5]謝培山，盛龍生，梁逸曾，等.中藥色譜指紋圖譜[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:128-129.

[6]盧靜華，彭纓，董自艷，等.不同產(chǎn)地連翹藥材的高效液相色譜特征圖譜研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30（19）:1625.

[7]吳立宏，朱恩圓，張紫佳，等.廣西產(chǎn)丁公藤原植物的調(diào)查及商品丁公藤主流品種的鑒定[J].中草藥，2005，36（9）:1398.

[8]徐飛，王曉中，張雷，等.HPLC測定寧夏枸杞中東莨菪素和東莨菪苷含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（13）:67.

[9]黃寶美，姚程煒，王志國，等.丁公藤中東莨菪內(nèi)酯含量的高效毛細管電泳電導法檢測[J].中山大學學報:自然科學版，2008，47（5）:71.

[10]譚建寧，張赟赟.RP-HPLC測定丁公藤中東莨菪內(nèi)酯的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10（6）:35.

[11]鄧良，袁華，喻宗沅.綠原酸的研究進展[J].化學與生物工程，2005，22（7）:4.

[12]劉明珠，李玲.用乙醇回流法從丁公藤中提取東莨菪素[J].第二軍醫(yī)大學學報，1995，16（5）:483.

[13]宋蔚，劉鎖蘭，李秀青，等.HPLC測定4種丁公藤類生藥中東莨菪素及東莨菪苷的含量[J].中國中藥雜志，2004，29（2）:185.