王玲玲，崔志明，徐冠華，保國鋒，孫郁雨，張金龍

（南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院脊柱外科，江蘇226001）

Prohibitin2（PHB2）是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)并且在進(jìn)化過程中高度保守的蛋白，研究顯示PHB2參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞生存、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、線粒體形態(tài)形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種過程[1]。目前對(duì)PHB2蛋白的研究主要集中在與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系方面，而它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及修復(fù)過程中是否發(fā)揮作用，鮮有報(bào)道。本研究通過建立大鼠脊髓損傷模型,檢測(cè)PHB2蛋白在脊髓損傷過程中表達(dá)變化，以探討其在脊髓損傷過程中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型 56只雌性SD大鼠，體重220～250g，隨機(jī)分為1個(gè)正常對(duì)照組和6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組各8只。采用10%水合氯醛（200mg/kg）腹腔注射麻醉，暴露T12節(jié)段脊髓。實(shí)驗(yàn)組按Allen打擊法，以一根光滑金屬棒（直徑4mm，重10g）從距脊髓表面10cm高處自由下落，撞擊脊髓致大鼠下肢完全癱瘓，縫合皮膚。術(shù)后維持室溫20℃～28℃，每天擠壓膀胱排尿兩次直至恢復(fù)自主排尿，飲水、飼料及光照不限。對(duì)照組只暴露T12節(jié)段脊髓而不致傷脊髓，其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.2 主要試劑 兔抗鼠Prohibitin2抗體（Sc-67045，Santa Cruz），DAB 顯色劑（北京中山生物技術(shù)有限公司）。β-actin單抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG以及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（均Sigma公司）。

1.3 組織固定、取材和切片 傷后6h、1d、3d、5d、7d和14d分別用同樣方法將將實(shí)驗(yàn)組大鼠麻醉后，生理鹽水心內(nèi)灌流后用4%多聚甲醛灌注，以損傷脊髓節(jié)段為中心，取長約10mm標(biāo)本。對(duì)照組均在脊髓暴露24h后經(jīng)灌注固定，取同樣長度脊髓標(biāo)本。所有取出脊髓組織均用4%多聚甲醛固定4h，之后置于30%蔗糖PBS溶液，待組織下沉后做10μm厚的冰凍切片待用。

1.4 Western blot提取脊髓蛋白質(zhì)樣品，在10%SDS0PAGE凝膠中電泳分離,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜后置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液，37℃條件下封閉2h，加入一抗（兔抗人Prohibitin2抗體或者β-actin單抗），4℃孵育過夜，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG），37℃作用2h，然后行化學(xué)熒光法（ECL）顯色并觀察。

1.5 免疫組織化學(xué) 取受傷后1d、3d和14d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，損傷脊髓組織頭端和尾端2mm處組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將取出的脊髓組織依次放入20%及30%蔗糖溶液內(nèi)梯度脫水，制成14μm厚的冰凍切片。將切片置于3%甲醇-H2O2溶液，37℃條件下孵育30min，然后用PBS洗3次，置于二抗血清封閉液中室溫孵育2h，吸除多余封閉液，滴加一抗后室溫孵育1h，接著4℃下過夜，再滴加二抗，37℃下孵育1h后滴加卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，繼續(xù)37℃下孵育40min，DAB顯色。最后用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，具有強(qiáng)和中等棕褐色著色的細(xì)胞記為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)對(duì)免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行組間差異性比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓損傷后Prohibitin2蛋白表達(dá)變化 取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組脊髓組織，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。Western blot結(jié)果顯示，脊髓損傷后，PHB2蛋白表達(dá)從6h開始迅速下降，持續(xù)至3d，之后逐漸上升，于14d后接近正常水平（圖1）。

圖1 prohibitin2的表達(dá)變化

2.2 免疫組織化學(xué)分析 結(jié)果顯示，PHB2在正常脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中均有表達(dá)，且分布較為均勻。挫傷后第1d，PHB2陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)在灰質(zhì)和白質(zhì)中的表達(dá)均有下降，傷后3d，陽性細(xì)胞數(shù)在脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中的表達(dá)均明顯下降。挫傷后第14d，陽性細(xì)胞數(shù)在脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中均有明顯恢復(fù)（圖2、3），陽性細(xì)胞數(shù)傷后1d及3d與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 prohibitin2免疫組化

圖3 不同時(shí)間陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)直方圖

3 討 論

脊髓急性損傷后，損傷區(qū)髓鞘和軸突崩解破壞，膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，疤痕增生。隨后損傷近段的軸突出芽、延伸，在這個(gè)神經(jīng)纖維再生修復(fù)的過程中，會(huì)涉及到細(xì)胞的再生及再生過程中一些細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)作用[2]。

PHB2是細(xì)胞的一種多功能蛋白質(zhì)，是在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)并且在進(jìn)化過程中高度保守的蛋白，參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，它最初做為與鼠的B淋巴細(xì)胞的IgM受體相互作用蛋白而被Terashima及其同事們發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，PHB2蛋白是以復(fù)合物的形式定位于線粒體[3]。同時(shí)，PHB2被發(fā)現(xiàn)可以借助其羧基端的結(jié)構(gòu)域定位在細(xì)胞核內(nèi)，所以PHB2蛋白被認(rèn)為很有可能是活動(dòng)于線粒體與細(xì)胞核之間的一種蛋白[4-5]。研究顯示PHB2參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞生存、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、線粒體形態(tài)形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種過程[6-8]。主要表現(xiàn)在PHB2能抑制細(xì)胞增殖，這種作用是細(xì)胞周期特異性的，主要在G期-S期之間發(fā)揮檢查點(diǎn)的作用，抑制核轉(zhuǎn)錄因子E2F的轉(zhuǎn)錄活性[9]。然而，又有研究表明，PHB2是胚胎發(fā)育所必須的。敲除大鼠PHB2導(dǎo)致PHB1和PHB2蛋白同時(shí)缺失，會(huì)損害大鼠的胚胎成纖維細(xì)胞增殖[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PHB2在脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中均勻分布，在脊髓損傷后后，PHB2的表達(dá)先降低，3d后降至最低點(diǎn)，后又逐漸上升，14d時(shí)接近于正常水平，而在脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)中的分布也均體現(xiàn)了相一致的變化，即在急性脊髓損傷后，PHB2的表達(dá)出現(xiàn)一定的時(shí)空變化特點(diǎn)，從而提示其可能參與了脊髓損傷和修復(fù)過程，也就是可能通過調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞的凋亡和增殖發(fā)揮了一定作用。但具體PHB2定位于脊髓組織中何種細(xì)胞，通過何種機(jī)制發(fā)揮作用，這些是需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

[1]Theiss AL，Sitaraman SV.The role and therapeutic potential of prohibitin in disease［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813（6）：1137-1143.

[2]Coates PJ，Nenutil R，McGregor A，et al.Mammalian prohibitin proteins respond tomitochondrial stress and decrease during cellular senescence［J］.Exp Cell Res，2001，265（2）：262-273.

[3]Matsuyama S，Nakano Y，Nakamura M，et al.Cloning and expression analysis of prohibitin mRNA in canine mammary tumors［J］.JVetMed Sci，2015，77（1）：101-104.

[4]Jia L，Yi XF，Zhang ZB，et al.Prohibitin as a novel target protein of luteinizing hormone in ovarian epithelial carcinogenesis［J］.Neoplasma，2011，58（2）：104-109.

[5]Artal-Sanz M，Tavernarakis N.Opposing function of mitochondrial prohibitin in aging［J］.Aging（Albany NY），2010，2（12）：1004-1011.

[6]Sievers C，Billig G，Gottschalk K，et al.Prohibitins are required for cancer cell proliferation and adhesion［J］.PLoS One，2010，5（9）：e12735.

[7]Fu P，Yang Z，Bach LA.Prohibitin-2 binding modulates insulin-like growth factor-binding protein-6 （IGFBP-6)-induced rhabdomyosarcoma cell migration［J］.J Biol Chem，2013，288（41）：29890-29900.

[8]Rossi L，Bonuccelli L，Iacopetti P，et al.Prohibitin 2 regulates cell proliferation and mitochondrial cristaemorphogenesis in planarian stem cells［J］.Stem Cell Rev，2014，10（6）：871-887.

[9]Theiss AL，Vijay-Kumar M，Obertone TS，et al.Prohibitin is a novel regulator of antioxidant response that attenuates colonic inflammation in mice［J］.Gastroenterology，2009，137（1）：199-208.

[10]Kasashima K，Ohta E，Kagawa Y，et al.Mitochondrial functions and estrogen receptor-dependent nuclear translocation of pleiotropic human prohibitin 2［J］.JBiol Chem，2006，281（47）：36401-36410.