劉 艷，蓋 領，茅國新

（南通大學附屬醫(yī)院腫瘤化療科，江蘇226001）

血漿DLC-1甲基化與肝細胞性肝癌患者臨床特征和預后的關系*

劉 艷**，蓋 領，茅國新

（南通大學附屬醫(yī)院腫瘤化療科，江蘇226001）

目的：研究肝細胞性肝癌患者血漿DLC-1甲基化狀態(tài)，研究其與各臨床相關因素的關系及對肝細胞性肝癌患者預后的意義。方法：采用甲基化特異性PCR法檢測肝細胞性肝癌患者和健康人群血漿中提取DNA的DLC-1甲基化狀態(tài)，結合臨床特征（性別、年齡、肝硬化、AFP水平、HbsAg及臨床分期），分析DLC-1甲基化狀態(tài)與肝細胞性肝癌患者復發(fā)轉移和預后的關系。結果：96例肝細胞性肝癌患者血漿中DLC-1甲基化陽性率為30.2%，對照健康組無甲基化，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。肝細胞性肝癌患者血漿DLC-1甲基化狀況與性別、年齡、抗-HBV、肝硬化無相關性（P＞0.05），與HBsAg、腫瘤大小、淋巴結轉移及TNM分期相關（P＜0.05）。DLC-1甲基化陽性組較陰性組轉移復發(fā)率高，存活率較甲基化陰性組低。結論：DLC-1基因甲基化狀態(tài)與肝細胞性肝癌發(fā)生發(fā)展及預后密切相關，對肝細胞性肝癌復發(fā)轉移預測具有重要的價值，有望成為評估肝細胞性肝癌預后的有效指標。

甲基化；DLC-1；肝細胞性肝癌；預后

近年來，多項研究表明基因的異常甲基化與肝細胞性肝癌的發(fā)生、進展和預后存在緊密關聯(lián)，可能對肝細胞性肝癌的診斷、治療以及預后具有重要價值[5-6]。有研究表明DLC-1基因在肝細胞性肝癌、乳腺癌、結直腸癌中常低表達或缺失，DLC-1基因DNA啟動子甲基化的改變通常是腫瘤抑制基因未被激活、蛋白未發(fā)揮其作用的重要機制[7]。DLC-1全稱為肝癌缺失基因1，定位于人類染色體8p22，目前認為是一種腫瘤抑制基因，DLC-1 DNA啟動子甲基化的改變通常是作為腫瘤抑制基因未被激活的重要機制[8-9]。本實驗通過甲基化特異性PCR（MSP）技術檢測分析DLC-1基因在肝細胞性肝癌患者血漿中甲基化狀態(tài)，分析血漿甲基化狀態(tài)與HCC復發(fā)轉移和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集南通大學附屬腫瘤醫(yī)院2008年3月—2009年10月間接受肝細胞性肝癌手術患者96例外周血，術后組織標本均經過病理證實，所有病例均有完整的臨床及隨訪資料，包括男75例，女性21例，抽血均在患者初入院時；96例健康體檢者為健康對照組，男72例，女24例，2組人員均空腹抽取外周靜脈血（抗凝），血液標本5mL，離心5～10分鐘，取上層血漿，-80℃低溫冰箱凍存或立即提取DNA。所有患者入組前均經知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Takara（寶生物工程大連公司）DNA提取試劑盒；EZ DNA甲基化試劑盒（北京天漠公司）；2XTag PCR MasterMix（北京天根公司）；Marker（北京天根公司）；美國Bio-rad瓊脂糖。

1.3 MSP方法 從患者和健康體檢者血漿中提取DNA，設計合成MSP引物，PCR反應體系：引物3μL，模板 3μL，10×PCR緩沖液 2.5μL，2.0mmol/L 4× dNTP混合物0.5μL，TaKaRaTM熱啟動Taq 0.5μL，25mmol/L MgCl22μL，甲基化擴增體系總體積為14.5μL。PCR反應過程：預變性95°C 12分鐘，40個循環(huán)變性94°C 15秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 40秒，延伸72°C 10分鐘,甲基化擴增體系除了退火溫度提高到56°C外其他均相同。判斷標準：（1）甲基化特異性引物擴增出目的條帶，非甲基化特異性引物無條帶擴增出，判斷為甲基化；（2）非甲基化特異性引物擴增出目的條帶，甲基化引物無條帶擴增出，判斷為非甲基化；（3）2對引物均擴增出目的條帶，這種情況稱為半甲基化或部分甲基化，也判斷為甲基化。

根據GenBank的甲基化引物由上海生工公司設計合成：

1.4 統(tǒng)計學處理 本組資料采用EpiData 3.02軟件錄入數(shù)據,SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料差異性比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存檢驗采用Log-rank檢驗，檢驗水準α=0.05。單因素和多因素COX回歸分析計算比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）。

2 結 果

2.1 MSP檢測HCC患者血漿DLC-1甲基化狀態(tài)在肝細胞性肝癌患者DLC-1血漿甲基化率為30.2%（29/96），正常對照人群中均未有甲基化，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DLC-1基因啟動子甲基化與96例肝細胞性肝癌患者的臨床特征關系見表1，肝細胞性肝癌患者血漿DLC-1基因甲基化狀態(tài)與HBsAg是否陽性、腫瘤大小、淋巴結轉移及TNM分期有關。在肝細胞性肝癌患者中，HBsAg陰性者DLC-1甲基化陽性率顯著高于HBsAg陰性者（P= 0.024）；腫瘤＜6cm者DLC-1甲基化陽性率顯著高于腫瘤＞6cm者（P=0.01）；淋巴結轉移患者甲基化陽性率顯著高于無淋巴結轉移患者（P=0.041）；晚期患者甲基化率顯著高于早期患者（P=0.013），而與患者年齡、性別、抗-HBV狀態(tài)、AFP水平及是否肝硬化間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 DLC-1甲基化狀態(tài)與預后的關系 隨訪96例肝細胞性肝癌患者是否發(fā)生轉移復發(fā)或死亡，部分患者未完全按照指定時間進行復查，直至病情嚴重時才得以確定復發(fā)或轉移，故以發(fā)生復發(fā)和轉移的具體時間為入院確診當天。其中5例失訪，截尾數(shù)據認為失訪患者死亡。96例肝細胞性肝癌患者中位無進展生存期（PFS）為8.2月，總生存期為17.5月。

表1 甲基化狀態(tài)與肝細胞性肝癌臨床病理特征之間的關系

對96例肝細胞性肝癌患者隨訪12個月，DLC-1甲基化陽性患者死亡率為89.65%（26/29），DLC-1甲基化陰性患者，疾病進展率為26.87%（18/ 67），死亡率73.13%（49/67）；DLC-1甲基化陽性患者與陰性患者PFS分別為5.1月和7.1月，OS分別為14.7月和25.8月，DLC-1甲基化陽性患者PFS、OS均短于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 DLC-1甲基化陽性與陰性肝細胞性肝癌患者PFS曲線圖

圖2 DLC-1甲基化陽性與陰性肝細胞性肝癌患者OS曲線圖

2.3 相關因素對肝細胞性肝癌患者預后影響的COX比例風險回歸分析 將患者性別、年齡、肝硬化、AFP水平、臨床分期、甲基化表達情況采用COX模型進行多因素回歸分析，結果顯示除腫瘤大小、TNM分期外（OR=2.366，OR=2.590），血漿DLC-1基因甲基化表達也是影響患者PFS及OS的獨立因素，相對危險度分別為4.343（P＜0.05），見表2。

表2 肝細胞性肝癌多因素生存分析結果

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多階段的復雜過程，涉及多種基因的功能異常，基因表觀遺傳學改變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。其中DNA甲基化是目前研究最廣泛、也是最重要的表觀遺傳修飾形式之一。DNA甲基化是指將腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基轉移酶的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5′位置的氫被活性甲基所取代，從而轉變成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的生物過程。正常的甲基化對于維持機體的功能是必需

的，但通過對DNA甲基化模式的研究發(fā)現(xiàn)，多個基因異常的DNA甲基化狀態(tài)存在于包括肝細胞性肝癌在內的多種腫瘤中，隨著對肝細胞性肝癌的抑癌基因及其影響因素等研究的深入，DLC-1異常甲基化研究日益受到重視[10-11]。

DLC-1基因通過GTP酶活性抑制腫瘤的轉移，抑制了一些癌基因的作用元件，從而在原發(fā)性肝癌中執(zhí)行抑制癌細胞增殖的功能[12]；DLC-1基因表達產物為RhoA和Cdc42特異性的GTP酶激活蛋白，主要通過下調Rho的活性而抑制腫瘤，與調控細胞增殖和粘附的信號傳導通路關系密切[13]，而DNA啟動子甲基化的改變通常是腫瘤抑制基因未被激活的重要機制。

我們將包括年齡、性別、肝硬化、腫瘤大小等在內的臨床參數(shù)資料與DLC-1甲基化進行了研究。與HbsAg相關性研究提示，DLC-1基因甲基化狀態(tài)與HBV感染有著顯著的關聯(lián)性（P=0.024）。DLC-1基因甲基化在HBV感染的肝細胞性肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的重要作用，其臨床意義有待于進一步探討。與臨床分期研究結果發(fā)現(xiàn)腫瘤的大小、腫瘤淋巴結轉移與肝細胞性肝癌甲基化顯著相關，腫瘤越大，轉移淋巴結數(shù)目越多，DLC-1甲基化越頻繁（P＜0.05）。此外，TNM分期與DLC-1甲基化也顯著相關，TNM III～Ⅳ期患者中的甲基化頻率顯著高于TNM I～Ⅱ期患者，且甲基化狀態(tài)呈現(xiàn)明顯增加的趨勢，提示抑癌基因DLC-1甲基化是肝細胞性肝癌發(fā)生的早期分子事件，隨著腫瘤的進展表達增高（P= 0.013）。其它臨床特征如腫瘤患者年齡、性別及肝硬化、AFP水平等臨床特征與甲基化差異則無統(tǒng)計學意義。由于在本研究中的例數(shù)較少，未檢測其肝硬化、AFP水平等臨床參數(shù)與DLC-1甲基化表達的關系，有待進一步加大樣本量研究。

本實驗探討了DLC-1基因甲基化與肝細胞性肝癌轉移復發(fā)的關系，結果提示DLC-1甲基化與肝細胞性肝癌轉移復發(fā)顯著相關，DLC-1甲基化可能是預測肝細胞性肝癌復發(fā)轉移的一個獨立的新的危險因素，但由于標本量和人群種族的限制，今后還需要大規(guī)模多中心的研究加以證實。

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Expression and clinical significance of DLC-1 DNA methylation in hepatocellular cancer

LIU Yan,GAI Ling,MAO Guoxin
(Department of Oncology,the Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001)

Objectives:To analyze the relationship between the promoter region DLC-1 DNA methylation status and the characteristics in hepatocellular cancer,and explore the role of DLC-1 DNA methylation in the occurrence and metastasis of hepatocellular cancer.Methods:96 cases of hepatocellular cancer specimens were selected,the methylation specific-PCR(MSP)was used to detect the tumor suppressor gene DLC-1 methylation in the above-mentioned tissues.To explore their roles of them in the occurrence and development of hepatocellular cancer,and the relationship associated with the clinical relevant factors.And to further analyze of the relationship between the promoter region of DLC-1 methylation status and the characteristics of methylation of the genome-wide in hepatocellular cancer.Disscussion the relationship between the methylation status with clinicopathologic factors(sex,age,AFP,differentiation degree,clinical stage,)and progression-free survival(PFS)as well as overall survival(OS)was analyzed.Results:The methylation status of DLC-1 in plasma of hepatocellular cancer patients was 30.1%.There were no correlations among the DLC-1 methylation status in hepatocellular cancer plasma and the patient's sex,age,cirrhosis and anti-HBV(P＞0.05),but it was correlated with degrees of differentiation TNM staging.Multivariate analysis indicated that besides the tumor size,the methylation status is also an independent risk factor influencing recurrence,also independently correlated with TTP and OS in hepatic patients. Conclusions:DLC-1 methylation shows great importance in the field of judging the prognosis.Tumor suppressor gene DLC-1 methylation is an early molecular index of hepatocellular cancer.

methylation;DLC-1;hepatocellular carcinoma;prognosis

R735.7

A

江蘇省衛(wèi)生廳資助項目（H200957）。

2015-09-19

1006-2440（2015）05-0443-04

**[作者簡介]劉艷，女，漢族，江蘇鹽城人，生于1985年12月，碩士研究生。研究方向：惡性腫瘤化學治療。 通信作者：茅國新，E-mail：MAOGX33@163.com

肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝臟惡性腫瘤，占全球腫瘤發(fā)生率的第五位[1]，其發(fā)生發(fā)展涉及染色體畸變、基因突變、表觀遺傳學改變、生長因子異常分泌和多種信號通路異常激活。表觀遺傳修飾主要包括DNA以及一些與DNA密切相關的蛋白質的化學修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑以及非編碼RNA等，其中DNA甲基化（methylation）是目前研究最廣泛、也

是最重要的表觀遺傳修飾形式之一[2-4]。