黨育平，袁小英，李 強(qiáng)，劉 瑋

人hDlg蛋白 PDZ結(jié)構(gòu)域的克隆及原核表達(dá)與純化

黨育平，袁小英，李 強(qiáng)，劉 瑋

黨育平

目的 探討人果蠅腫瘤抑制蛋白hDlg的 PDZ結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的表達(dá)與純化。方法 從HeLa細(xì)胞中設(shè)計(jì)引物克隆含有hDlg PDZ cDNA片段后進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，并連接至T載體進(jìn)行測(cè)序鑒定，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接至pGEX-6p-1原核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌后37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果 測(cè)序和雙酶切鑒定hDlg的PDZ結(jié)構(gòu)域被成功克隆至pGEX-6p-1原核表達(dá)載體。37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后，大部分GST-PDZ融合蛋白以包涵體的形式存在，部分存在于細(xì)菌裂解上清液中。16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后，無(wú)法檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。通過(guò)GST-beads結(jié)合的方式對(duì)細(xì)菌裂解液進(jìn)行純化，可溶性GST-PDZ的蛋白量可以顯著提高。結(jié)論 通過(guò)GST-PDZ誘導(dǎo)表達(dá)，再通過(guò)GST-beads結(jié)合純化的方式成功表達(dá)可溶性的hHlg PDZ結(jié)構(gòu)域。

人乳頭瘤病毒；hDlg；PDZ結(jié)構(gòu)域；原核表達(dá)

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一類(lèi)分子量較小的無(wú)包膜的雙鏈環(huán)狀嗜上皮性DNA 病毒，主要感染人皮膚或黏膜上皮細(xì)胞。在我國(guó)HPV引起的生殖器部位感染發(fā)病率逐年升高[1]。在婦性，高危型HPV感染主要引發(fā)宮頸病變，導(dǎo)致婦女子宮頸部位的細(xì)胞惡變，惡變轉(zhuǎn)化后的癌細(xì)胞在體內(nèi)能夠形成失控性增生，并可能發(fā)生轉(zhuǎn)移[2,3]。目前共有170種不同類(lèi)型的HPV病毒被分離鑒定[4]，但并非所有的HPV感染均引發(fā)癌癥，只有HPV16 和HVP18具有致癌性[5]。高危型HPV編碼3種癌蛋白(E5、E6和E7)，其中以E6的致癌作用最為重要,與病毒感染細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[6]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV E6與一組含有PDZ結(jié)構(gòu)域功能蛋白間的相互作用與其致癌性密切相關(guān)[7]。人類(lèi)的hDlg (human homologue of the drosophila discs large tumor suppressor protein )基因作為一種含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白被發(fā)現(xiàn)同高危型的HPV E6結(jié)合[6,8]。而HPV E6和hDlg PDZ結(jié)構(gòu)域之前的結(jié)合也可能成為未來(lái)潛在的宮頸癌或HPV感染的治療位點(diǎn)。本研究嘗試克隆hDlg的PDZ結(jié)構(gòu)域，在大腸桿菌中表達(dá)純化和GST融合的PDZ結(jié)構(gòu)域，為未來(lái)研究HPV感染的治療提供基礎(chǔ)和新思路。

1 材料與方法

1.1 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆

含有PDZ結(jié)構(gòu)域的人hDIg 蛋白的mRNA通過(guò)總RNA提取，使用TRizol 試劑（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA），按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，從本實(shí)驗(yàn)室自行保存的HeLa細(xì)胞中提取。提取純化后的RNA經(jīng) 過(guò)RNase-free DNase (Promega, Madison, Wisconsin, USA)處理去除基因組DNA污染，使用 AMV reverse transcriptase（Promega，Madison, Wisconsin, USA），按照說(shuō)明書(shū)混合使用Oligodt和隨機(jī)六聚脫氧核苷酸（randomhexamer）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10倍稀釋后用基因特異性引物進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第1輪擴(kuò)增所使用引物為上游引物PDZ-F1：ATGCCGGTCCGGAAGCAAGATAC CCAGAGA；下游引物為PDZ-R1：ATGGTTATCA ACAGGCTGAG AAGAAGAGTT；PCR產(chǎn)物為1215 bp。在第1輪擴(kuò)增完成后，將PCR產(chǎn)物稀釋100倍，作為模板，進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。第2輪PCR擴(kuò)增使用上游引物為PDZ-F2：AAGAATTCGAAATAAA GCTCATTAAAGGT；下游引物為PDZ-R2：AAGTC GACCTCGAGGGGTTTTGCCACTTTCAAATA；擴(kuò)增目的片段為261 bp。反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增所使用儀器為Bio-Rad iCycle(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）。PCR產(chǎn)物在含有溴化乙錠（EB）的1%瓊脂糖（Agarose，購(gòu)自Sigma，St. Louis, MO，USA）上使用75 V電壓運(yùn)行45 min后，使用ChemiDoc XRS Image System(Bio-Rad)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，圖像使用QuantityOne程序（Bio-Rad）攝像，并記錄處理。

1.2 含有PDZ結(jié)構(gòu)域的T載體及原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將第2輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳后，使用Wizard PCR& Gel cleanup systerm（Promega）按照說(shuō)明書(shū)操作純化PCR產(chǎn)物，再按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作連接至pGEM?-T Vector Systems（Promega）后，通過(guò)熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，使用EcoRⅠ（Promega）和XhoⅠ（Promega）酶切鑒定陽(yáng)性克隆。

將T載體上的PDZ結(jié)構(gòu)DNA片段用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切回收后，使用T4 DNA連接酶連接至pGEX-6p-1原核表達(dá)載體中，用于連接反應(yīng)的pGEX-6p-1原核表達(dá)載體預(yù)先使用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切。并使用TSAP（Promega）處理脫磷酸以降低假陽(yáng)性菌落，鏈接產(chǎn)物按照先前所述用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中[9]，其后挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。所有使用的限制性內(nèi)切酶和TSAP均購(gòu)自Promega，并按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。1.3 GST-PDZ蛋白的原核表達(dá)及純化鑒定

含有PDZ片段的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-PDZ通過(guò)熱激法被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21表達(dá)菌株中。 含有質(zhì)粒的BL21大腸桿菌于正常的LB(Sigma)培養(yǎng)基上在搖床上以220 r/min在37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后從過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌中，吸取2 ml菌液，做500倍的稀釋后在搖床上以250 r/min培養(yǎng)2～3 h。在培養(yǎng)的過(guò)程中，每間隔10 min吸取菌液檢測(cè)A600值，在A600的數(shù)值達(dá)到0.8時(shí)，按照1 mmol/L的量加入IPTG(Sigma)誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)重組蛋白，并在搖床上繼續(xù)培養(yǎng)3 h。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，細(xì)菌的培養(yǎng)溫度分為37 ℃和16 ℃兩種，分別比較兩種不同的溫度條件下重組蛋白表達(dá)產(chǎn)量。

對(duì)細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，以10 000 r/min離心菌液，然后使用含有5 mmol/L EDTA(Sigma)pH 7.2的PBS緩沖液重懸，比例為每1.5 ml菌液對(duì)應(yīng)的細(xì)菌沉淀使用100 μl PBS緩沖液重懸細(xì)菌后，使用超聲波裂解儀（(Model Q500, QsonicaSonicator Ultrasonic Processor,Newtown, CT，USA），按照輸出電壓1 000 V rms和20 kHz的頻率，以10 s超聲波，10 s暫停為1個(gè)周期，共裂解6個(gè)周期。其后，將細(xì)菌裂解液在4 ℃下，按照14 000 g的離心力離心10 min，分為離心沉淀部分與上清部分。分別按照先前的報(bào)道與Lameani sample buffer混合后，煮沸10 min變性蛋白，再進(jìn)行SDS-PAGE[10]。

2 結(jié)果

2.1 含有PDZ結(jié)構(gòu)域的T載體及原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

為了克隆完整的PDZ結(jié)構(gòu)域，采用兩步法進(jìn)行克隆，第1對(duì)引物克隆一段長(zhǎng)度為1215 bp的DNA片段，含有PDZ結(jié)構(gòu)域（圖1a）。由于此片段粘端并不能直接克隆至T載體，進(jìn)一步設(shè)計(jì)第2對(duì)引物，克隆出完整的PDZ結(jié)構(gòu)域DNA片段（261 bp），并且將其連接至T載體上，使用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆后（圖1b），測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性。再將PDZ結(jié)構(gòu)域的片段從T載體上切下，連接至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，酶切檢測(cè)陽(yáng)性克隆，其PDZ片段為261 bp（圖1c）。

圖1 PDZ結(jié)構(gòu)域的克隆與酶切鑒定

2.2 GST-PDZ在大腸桿菌BL21株的表達(dá)

成功構(gòu)建原核表達(dá)載體后，原核表達(dá)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌，分別用正常37 ℃誘導(dǎo)和低溫16 ℃誘導(dǎo)的方式檢測(cè)蛋白表達(dá)量，在37 ℃誘導(dǎo)后，細(xì)菌自身蛋白的表達(dá)明顯減少；細(xì)菌裂解后，大部分GSTPDZ蛋白以不可溶的包涵體形式存在，另外一部分存在于可溶性的上清液中（圖2a）。與此同時(shí)，在16 ℃低溫誘導(dǎo)組，GST-PDZ的表達(dá)量則低于可檢測(cè)水平，無(wú)論在上清液還是包涵體沉淀中，均無(wú)GSTPDZ的表達(dá)（圖2b）。

圖2 PDZ結(jié)構(gòu)域在BL21菌中的表達(dá)

2.3 GST-PDZ的表達(dá)后純化

在確認(rèn)了GST-PDZ的表達(dá)后，通過(guò)GST-beads 將37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌蛋白裂解液上清和GST-beads進(jìn)行結(jié)合，嘗試對(duì)重組蛋白進(jìn)行更進(jìn)一步的純化。GST-PDZ依然大量以包涵體的形式存在。但是通過(guò)GST-beads的結(jié)合后，上清液中的大部分融合蛋白均與beads相結(jié)合，而在洗液中則明顯減弱，顯示GST-beads的結(jié)合可以更進(jìn)一步從裂解液中純化可溶性的重組蛋白（圖3）。

圖3 PDZ結(jié)構(gòu)域的純化

3 討論

高危型HPV所編碼的2種早期基因E6和E7是其致癌性的關(guān)鍵基因[11]。在這兩種癌蛋白中，E6被認(rèn)為在HPV的致癌性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一般認(rèn)為高危型HPV E6主要通過(guò)抑制抑癌蛋白p53而發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能[7]。但近年的研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV E6對(duì)p53的作用不能完全解釋其轉(zhuǎn)化功能。在一些實(shí)驗(yàn)中，高危型HPV E6的突變體雖然不能誘導(dǎo)p53的降解，卻仍然能使上皮細(xì)胞永生化[8]。而一些E6突變體雖然保留對(duì)p53的抑制作用，但并無(wú)轉(zhuǎn)化功能[7]。而在此基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV E6與一組含有PDZ結(jié)構(gòu)域功能蛋白間的相互作用與其致癌性密切相關(guān)[7]。

PDZ是最早發(fā)現(xiàn)含有此結(jié)構(gòu)域的3種蛋白質(zhì)首字母的縮寫(xiě)（post-syn-aptic density protein-95 PSD-95/ SPA90, discs-large protein/drosophila tumor suppressor DLG-A, zonula occludens-1 ZO-1）[12]。PDZ蛋白多位于膜內(nèi)或膜外, 是一段大約有80～90氨基酸長(zhǎng)保守序列，與細(xì)胞骨架有廣泛的聯(lián)系[13]。PDZ蛋白參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、蛋白運(yùn)輸、降解、細(xì)胞骨架組織和基因表達(dá)等眾多的生物學(xué)過(guò)程[12,13]。而所有高危HPV E6一個(gè)顯著特征在其碳末段都有一個(gè)高度保守的含有4的氨基酸殘基的PDZ結(jié)合序列，盡管該區(qū)域不涉及與p53結(jié)合和降解，但與其轉(zhuǎn)化活性有關(guān)[14,15]。

第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)同高危HPV E6結(jié)合含有PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白是hDlg[8]。 作為果蠅惡性腫瘤抑制蛋白因子Dlg的人類(lèi)同源基因，hDlg與Dlg有60%氨基酸相同，是一種膜相關(guān)的鳥(niǎo)苷酸激酶蛋白(MAGUK)家族成員，主要起細(xì)胞支架和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[8]。研究也提示hDlg可能起抑制腫瘤的作用[8]。細(xì)胞極性是上皮組織的一個(gè)標(biāo)志性特點(diǎn)，極性丟失與上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

在筆者的研究中，嘗試表達(dá)純化人hDlg的PDZ結(jié)構(gòu)域，并期望未來(lái)以此為基礎(chǔ)嘗試研究能夠抑制高危型HPV E6和hDlg PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的肽段。除GST融合蛋白外，也同時(shí)嘗試表達(dá)MBP（maltosebinding protein，麥芽糖結(jié)合蛋白）融合PDZ蛋白，以及攜帶His標(biāo)簽的PDZ融合蛋白嘗試提高可溶性PDZ蛋白的表達(dá)。然而，無(wú)論是在37 ℃還是在16℃下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，MBP-PDZ和His-PDZ的表達(dá)在SDS-PAGE上均無(wú)法被檢測(cè)到。因此，盡管大部分GST-PDZ的融合蛋白以不可溶的包涵體存在，但GST融合蛋白似乎是惟一可行的原核表達(dá)方式，并且能夠通過(guò)與GST-beads結(jié)合的方式來(lái)對(duì)重組蛋白進(jìn)行一定的富集作用。在未來(lái)的研究中，將更進(jìn)一步以重組表達(dá)的GST-PDZ為基礎(chǔ)進(jìn)行下一步研究。

[1] 肖子娥, 黃捷. 尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè) [J]. 實(shí)用皮膚病學(xué)雜志, 2014, 7(2):99-101.

[2] Boshart M, Gissmann L, Ikenberg H, et al. A new type of papillomavirus DNA, its presence in genital cancer biopsies and in cell lines derived from cervical cancer [J]. EMBO J, 1984, 3(5):1151-1157.

[3] Dürst M, Gissmann L, Ikenberg H, et al. A papillomavirus DNA from a cervical carcinoma and its prevalence in cancer biopsy samples from different geographic regions [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80(12):3812-3815.

[4] Bzhalava D, Guan P, Franceschi S, et al. A systematic review of the prevalence of mucosal and cutaneous human papillomavirus types [J]. Virology, 2013, 445(1-2):224-231.

[5] Mu?oz N, Bosch FX, de Sanjosé S, et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer [J]. N Engl J Med, 2003, 348(6):518-527.

[6] Manzo-Merino J, Thomas M, Fuentes-Gonzalez AM, et al. HPV E6 oncoprotein as a potential therapeutic target in HPV related cancers [J]. Expert Opin Ther Targets, 2013, 17(11):1357-1368.

[7] Sanclemente G, Gill DK. Human papillomavirus molecular biology and pathogenesis [J]. J Eur Acad Dermatol Venereol, 2002, 16(3):231-240.

[8] Caruana G, Bernstein A. Craniofacial dysmorphogenesis including cleft palate in mice with an insertional mutation in the discs large gene [J]. Mol Cell Biol, 2001, 21(5):1475-1483.

[9] Froger A, Hall JE. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method [J]. J Vis Exp, 2007, (6):253.

[10] Patel D, Nan Y, Shen M, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus inhibits type I interferon signaling by blocking STAT1/ STAT2 nuclear translocation [J]. J Virol, 2010, 84(21):11045-11055.

[11] Tsao SW, Mok SC, Fey EG, et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs)[J]. Exp Cell Res, 1995, 218(2):499-507.

[12] Jeleń F, Oleksy A, Smietana K, et al. PDZ domains - common players in the cell signaling [J]. Acta Biochim Pol, 2003, 50(4):985-1017.

[13] Schlieker C, Mogk A, Bukau B. A PDZ switch for a cellular stress response [J]. Cell, 2004, 117(4):417-419.

[14] Kiyono T, Hiraiwa A, Fujita M, et al. Binding of high-risk human papillomavirus E6 oncoproteins to the human homologue of the Drosophila discs large tumor suppressor protein [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(21):11612-11616.

[15] Watson RA, Thomas M, Banks L, et al. Activity of the human papillomavirus E6 PDZ-binding motif correlates with an enhanced morphological transformation of immortalized human keratinocytes [J]. J Cell Sci, 2003, 116(Pt 24):4925-4934.

Prokaryotic expression and purification of hDlg PDZ domain in E.coli BL21 strain

DANG Yu-ping，YUAN Xiao-ying，LI Qiang，et al
Department of Dermatology, Airforce General Hospital of Chinese People's Liberation Army, Beijing 100142, China

Objective To investigate the expression and purification of hDlg PDZ domain in E.coli BL21 strain. Methods The cDNA fragment containing PDZ domain was cloned from total RNA of HeLa cell. The second round PCR was conducted to clone the PDZ domain. Then the PDZ domain was ligated to T vector. EcoRⅠ and XhoⅠ were used to release the PDZ domain with adequate restriction cites from T vector and the released fragment was cloned to pGEX-6p-1 expressing vector for prokaryotic expression in E.coli BL21. Results DNA sequencing and restriction enzyme digest were conducted to verify the insertion of PDZ domain in pGEX-6p-1 vector. After IPTG induction under 37℃, the GST-fusion protein was mainly existed as inclusion body with less fusion protein existed in supernatant. However, the fusion protein expression was under detectable level if IPTG induction was performed under 16℃. The GST-beads binding assay could be conducted to enrich the GST-PDZ from supernatant of bacterial lysate. Conclusion The PDZ domain of hDlg could be successfully expressed as GST fusion protein and GST-beads binding assay could be used for purify the soluble form of GST-PDZ.

HPV； hDlg； PDZ domain；Expression，prokaryotic [J Pract Dermatol, 2015, 8(6):415-418]

R752

A

1674-1293(2015)06-0415-04

2015-07-05

2015-08-18）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150604

100142 北京，空軍總醫(yī)院皮膚科（黨育平，袁小英，李強(qiáng)，劉瑋）

黨育平，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：人乳頭瘤病毒致病機(jī)制及疫苗的研究，E-mail: 6106215676@qq.com

劉瑋，E-mail: lwei5811@126.com